Name: Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprenda a analisar a localização de proteínas em plasmodesmos de Nicotiana benthamiana usando microscopia confocal. Este método revela dinâmicas de transporte celular durante infecções virais em plantas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Explorando a função dos plasmodesmos: microscopia confocal de proteínas-alvo

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Motor ABT AC 1 fase</td><td>BRANDTECH&</td><td>nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><<tr><td>em>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controle de contaminação&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Mistura enzimática</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Mistura enzimática</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>National Institutes of Health e o Laboratório de Instrumentação</td><td></td><td></td>Óptica e Computacional</tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Espécies</td><td></td><td></td>de plantas</tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>NEB</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em nicotiana benthamiana

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Para facilitar os estudos da função da DP na fisiologia vegetal e nas interações com patógenos, três proteínas de referência simples e confiáveis foram desenvolvidas para a localização da DP. Duas proteínas PD celulares e uma proteína MP derivada do patógeno codificada pelo tobamovírus vegetal TVCV foram selecionadas. A localização subcelular dessas proteínas foi visualizada usando um repórter autofluorescente EGFP fundido ao terminal C de cada proteína. Em uma abordagem alternativa, os DP foram visualizados usando coloração com azul de anilina dos depósitos de calose associados à DP. Os experimentos mostraram que tanto PDLP5 quanto MP exibiram localização PD pontilhada, com MP também localizada no núcleo da célula (Figura 1A), como observado anteriormente25. Em contraste, PDCB1 pareceu particionar entre PD e ER (Figura 1A). Para pesquisadores menos experientes na interpretação da localização subcelular de proteínas marcadas com GFP, a Figura 1A também ilustra o padrão nucleocitoplasmático característico do EGFP expresso em células vegetais. Para confirmar o sinal ER do PDCB1, co-expressamos PDCB1 com um marcador ER e descobrimos que o sinal PDCB1 se sobrepunha ao sinal do marcador ER (Figura 1B). Para avaliar a eficiência da localização de PD das proteínas testadas, foi calculada a porcentagem de células que expressam o sinal fluorescente que exibiram localização de PD desse sinal (Tabela 1).
Para a identificação da localização subcelular empregando proteínas de referência, é útil entender a escala de tempo da expressão da proteína de referência e as possíveis mudanças de sua localização. A Figura 2 mostra essa cinética para MP, PDLP5 e PDCB1 quando os próprios PD foram visualizados pela coloração com azul de anilina. Tanto o MP quanto o PDLP5 começaram a se acumular no PD já no pós-infiltração de um dia (dpi), e esse acúmulo atingiu um máximo aparente em 2 dpi, permanecendo estável por mais 5 dias, após os quais a intensidade do sinal diminuiu, provavelmente devido à degradação da proteína. O curso de tempo da classificação subcelular do PDCB1 foi mais complexo: nos primeiros 3 dpi, o PDCB1 exibiu um sinal ER comparativamente forte, que obscureceu quase completamente a localização do sinal específico do PD, enquanto que em 5 dpi, este último sinal tornou-se mais pronunciado (Figura 2), embora em menos células. Curiosamente, o surgimento do padrão de localização PD claro de PDCB1 após 5 dpi coincidiu com substancialmente menos células mostrando o sinal EGFP (Figura Suplementar 1). Assim, PDLP5 e MP podem funcionar como proteínas de referência de PD com pouco background na maioria dos outros compartimentos celulares, com uma janela de tempo de visualização ideal de 2-5 dpi. PDCB1, por outro lado, não é tão adequado quanto um marcador de DP.
Verificou-se, então, que os marcadores de DP mantêm sua especificidade de localização subcelular na presença de outras proteínas de DP. Para este fim, MP-EGFP ou PDLP5-EGFP foi co-expresso com um PD-localizando26 MP de outro vírus de planta, o vírus do mosaico do tabaco (TMV) marcado com CFP. A Figura 3 mostra que, em ambos os casos, as proteínas co-expressas exibiram um padrão claro de localização da DP. Da mesma forma, a coloração histológica de azul de anilina específica para PD dos tecidos que expressam MP-EGFP ou PDLP5-EGFP não detectou interferência na localização de PD dos sinais de EGFP e azul de anilina (Figura 3).
Os estudos de localização de DP geralmente se beneficiam de uma estimativa mais quantitativa da expressão geral da proteína de referência e do sinal de PD. Essa abordagem de quantificação é ilustrada na Figura 4 e na Figura 5. Para a quantificação da expressão geral, foi medida a intensidade do sinal de PDLP5 e MP. Ambas as proteínas apresentaram sinais fortes em todos os momentos de visualização durante o período de 10 dpi, com intensidade máxima de sinal em 3 dpi para PDLP5 e em 2 dpi para MP (Figura 4). Não houve diferenças estatisticamente significativas na intensidade do sinal entre PDLP5 e MP em nenhum dos momentos de visualização. A intensidade do sinal PDCB1 exibiu maior flutuação entre os momentos, com o sinal mais forte observado em 7 dpi (Figura 4), embora tenha sido difícil coletar dados estatisticamente significativos neste momento devido à escassez de células de expressão. Assim, os primeiros 3 dpi representam o tempo ideal para detectar a expressão de PDCB1. Como esperado, as amostras de coloração com azul de anilina exibiram um sinal mais estável do que as proteínas expressas transitoriamente (Figura 4).
Os pontos de PD formados por PDLP5 e MP foram então quantificados. O PDLP5 mostrou um número estável de pontos de DP durante todo o período de observação, sem diferenças estatisticamente significativas entre os dois pontos de tempo testados (Figura 5). O maior número de pontos de PD formados por MP foi detectado em 2 dpi, e eles permaneceram relativamente estáveis até o final do período de observação. A comparação dos números de pontos de DP entre PDLP5 e MP não revelou diferenças estatisticamente significativas na maioria dos momentos de amostragem (Figura 5). O número de pontos de PD corados com azul de anilina também permaneceu estável, embora tenha diminuído ligeiramente a 10 dpi. Os números de pontos de PD decorados por azul de anilina, PDLP5 ou MP foram semelhantes entre si com significância estatística (Figura 5), consistente com a especificidade de PD desses marcadores. Os números de pontos de PD para PDCB1 não foram analisados porque, em pontos de tempo anteriores, o sinal de PD foi obscurecido pelo sinal de ER e, em pontos de tempo posteriores, foi observado em apenas algumas células relativamente poucas (ver Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> Figura 1: Localização de plasmodesmos (PD) de TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 expressos transitoriamente em Nicotiana benthamiana e coloração de azul de anilina de PD. (A) Localização de PD de MP-EGFP, PDLP5-EGFP e PDCB1-EGFP e coloração de anilina. O sinal EGFP está em verde, o sinal azul de anilina está em azul e a autofluorescência de plastídio está em vermelho. (B) Co-expressão de MP-EGFP, PDLP5-EGFP e PDCB1-EGFP com o marcador de retículo endoplasmático (ER) marcado com mRFP. As imagens foram registradas 2 dias após a infiltração (dpi) e são seções confocais únicas representativas de dois experimentos independentes (N = 20 imagens de 2 plantas). O sinal EGFP está em verde, o sinal mRFP está em roxo e a autofluorescência de plastídio está em vermelho. As setas amarelas indicam PDCB1 localizado no ER. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> Figura 2: Curso temporal da localização da DP de TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 expressos transitoriamente em Nicotiana benthamiana e da coloração com azul de anilina da DP. As imagens foram gravadas a 2 dpi e são seções confocais únicas representativas de dois experimentos independentes (N = 20 imagens de 2 plantas para todos os sistemas, exceto 7 dpi e 10 dpi para PDCB1-EGFP, em que menos células exibiram o sinal). O sinal EGFP está em verde e o sinal azul de anilina está em azul. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> Figura 3: TVCV MP e PDLP5 mantêm sua localização PD após a co-expressão com um MP TMV localizador de PD e cocoloração com azul de anilina. As imagens foram gravadas a 2 dpi e são seções confocais únicas representativas de N ≥ 10 imagens de 4-6 plantas. O sinal EGFP está em verde, o sinal CFP e o sinal azul de anilina estão em azul e a autofluorescência do plastídio está em vermelho. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> Figura 4: Curso temporal da intensidade de fluorescência de TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 expressos transitoriamente na coloração Nicotiana benthamiana e azul de anilina PD. Os dados quantitativos foram coletados dos experimentos descritos na Figura 2. As barras de erro representam o desvio padrão da média de vários experimentos. Os pontos de dados individuais são indicados como a média para cada medição. As diferenças entre os valores médios avaliados pela ANOVA de duas vias com o teste de comparações múltiplas de Tukey são estatisticamente significativas para os valores de P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01 e ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001; ns, não estatisticamente significativo. Barras azuis, coloração de anilina; barras verdes claras, MP-EGFP, barras verdes escuras, PDLP5-EGFP; barras amarelas, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> Figura 5: Curso temporal da formação de pontos de PD por TVCV MP e PDLP5 expressos transitoriamente em Nicotiana benthamiana e por coloração com azul de anilina de PD. Os dados quantitativos foram coletados dos experimentos descritos na Figura 2. As barras de erro representam o desvio padrão da média de vários experimentos. Os pontos de dados individuais são indicados como a média para cada medição. As diferenças entre os valores médios avaliados pela ANOVA de duas vias com o teste de comparações múltiplas de Tukey são estatisticamente significativas para os valores de P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001. Barras azuis, coloração de anilina; barras verdes claras, MP-EGFP, barras verdes escuras, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">Experiência I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Total de células</td>
			<td>Células com localização PD</td>
			<td>Células com sinal misto</td>
			<td>Células com localização de DP (%)</td>
		</tr><tr><td>Azul de anilina</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">Experiência II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Total de células</td>
			<td>Células com localização PD</td>
			<td>Células com sinal misto</td>
			<td>Células com localização de DP (%)</td>
		</tr><tr><td>Azul de anilina</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Eficiência da localização de DP.
Figura suplementar 1: Localização PD de TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 expressos transitoriamente em Nicotiana benthamiana. As imagens foram gravadas a 5 dpi (A), 7 dpi (B) e 10 dpi (C). O sinal EGFP é verde e a autofluorescência plastidial é vermelha. Barras de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

confocal-microscopy-analysis-protein-sorting-to-plasmodesmata

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tráfico macromolecular entre células vegetais pode ser avaliado por transitoriamente expressar uma proteína fluorescente-tag de interesse e análise de sua distribuição intra-e intercelular por microscopia confocal.

A célula-célula Assay Transporte Macromoleculares Na Planta Utilizando Bombardeio biobalística

Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

Os primórdios das folhas de milho são profundamente embainhados e enrolados, tornando-os difíceis de estudar. Aqui, apresentamos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais.

Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras não enroladas de primordia de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais

Aprenda a analisar a localização de proteínas em plasmodesmos de Nicotiana benthamiana usando microscopia confocal. Este método revela dinâmicas de transporte celular durante infecções virais em plantas.

Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

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