Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Nossa pesquisa se concentra em doenças neurodegenerativas progressivas caracterizadas pelo acúmulo da proteína nuclear TDP-43 no citoplasma, como ALS ou FTLD-TDP. Nosso objetivo é entender como as patologias do TDP-43 se espalham pelo cérebro de maneira semelhante a um príon. Descobrimos anteriormente que a liberação de TDP-43 via vesículas extracelulares é mediada pela desregulação da autofagia.

A progranulina do FTLD-TDP facilita esse processo. O próximo desafio é esclarecer como a autofagia regula a produção e liberação de vesículas extracelulares contendo TDP-43, o que pode levar à descoberta de alvos terapêuticos para ELA ou FTLD-TDP. Para começar, pegue as células HeLa cultivadas, conte-as usando um contador de células e semeie uma vezes dez elevado a seis células em uma placa de seis centímetros contendo um meio de cultura.

Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade controlada por 24 horas. Em seguida, prepare uma solução de siRNA de 20 micromolares. Misture 100 microlitros de meio sérico reduzido e três microlitros de siRNA em um tubo de baixa retenção para preparar a Solução A. Em seguida, misture 100 microlitros de meio de soro reduzido e cinco microlitros de reagente de transfecção em um tubo de baixa retenção para preparar a Solução B. Depois disso, misture a Solução A e a Solução B e, em seguida, incube a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos.

Agora adicione a mistura das soluções A e B ao meio usado para cultivar células HeLa e incubar por 24 horas. No dia seguinte, lave as células com PBS e exponha as células a 500 microlitros de 0,25% de tripsina e uma solução milimolar de EDTA a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade controlada por cinco minutos. Em seguida, adicione 2,5 mililitros do meio de cultura às células e, usando uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 20 microlitros, prepare uma suspensão de célula única.

Depois de contar as células, semeie uma vezes dez elevado a seis células em uma placa de dez centímetros e incuba, conforme demonstrado anteriormente. No final da incubação, preparar o meio de cultura contendo o veículo ou a bafilomicina A1 100 nanomolar. Em seguida, exponha as células ao meio que contém o veículo ou a bafilomicina A1 100 nanomolar e incube por 24 horas. No dia seguinte, colete todo o meio de cultura da placa de 10 centímetros.

Transferir o meio recolhido para um tubo de 15 mililitros e centrifugá-lo a 3 000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os restos celulares. Para isolar a fração de vesícula extracelular P1, transferir o sobrenadante após centrifugação a 3.000 G para um tubo de centrifugação. Centrifugar o tubo a 20 000 g a quatro graus Celsius durante uma hora.

Para o isolamento da fracção da vesícula extracelular P2, transferir o sobrenadante após centrifugação a 20 000 G para um tubo de ultracentrifugação. Centrifugar a 110 000 g a quatro graus Celsius durante uma hora. Depois de limpar o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório, ressuspenda os pellets restantes no tubo de centrifugação em 50 microlitros de tampão de amostra dupla para preparar a fração de vesícula extracelular P1.

Em seguida, remover o sobrenadante por decantação. Limpe o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório e ressuspenda os pellets restantes no tubo de ultracentrifugação em 50 microlitros de tampão de amostra dupla para preparar a fração de vesícula extracelular P2. Incube as frações de vesículas extracelulares P1 e P2 a 100 graus Celsius em um bloco de calor por 10 minutos.

Depois de transferir o meio de cultura da placa de 10 centímetros para um tubo de 15 mililitros, lave as células do prato de 10 centímetros com PBS. Em seguida, exponha as células a dois mililitros de tripsina a 0,25% e uma solução milimolar de EDTA a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade controlada por cinco minutos. Adicione oito mililitros de meio de crescimento às células.

Usando uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 microlitros conectada, pipete as células para preparar uma suspensão de célula única. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugar a 1 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante usando um aspirador.

Adicione PBS ao pellet da célula e centrifugue a 1.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o PBS, sonicar o pellet celular em um mililitro de tampão A68 contendo 1% de sarcosil. Misture 300 microlitros do lisado celular com 100 microlitros de tampão de amostra de quatro vezes.

Incube a mistura a 100 graus Celsius em um bloco de calor por 10 minutos para preparar a fração celular.