Name: Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Explore como a autofagia regula a liberação de TDP-43 via vesículas extracelulares em células HeLa. Este método ajuda pesquisadores a identificar alvos terapêuticos para ELA e FTLD-TDP.

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<meta charset="utf8"></head><body>Avaliando a liberação de EV positiva para LC3-II na autofagia com fusão de lisossomo prejudicada

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
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<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
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<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 10 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Ponta de Pipeta L</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>pipetagem</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>um material para solução tampão de amostra</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidina Tetracloridrato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>um material para solução DAB</td></tr><tr><td>3.5 cm Prato&nbsp;</td><td>Prato Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 cm&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Banhos termostáticos de bloco de alumínio (termobanhos secos)</td> <td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>solução inalatória</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>Vetor de anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com biotina</td><td> Laboratórios&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>2º anticorpo para immunoblotting</td></tr><tr><td>Anticorpos IgG para Cavalos Conjugados com Biotina IgG Antibody Vector</td><td>Laboratories&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>2º anticorpo para immunoblotting</td></tr><tr><td>Bloqueando um</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>um material para immunoblotting</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>um material para solução tampão de amostra</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>Scanner</td></tr><tr><td>Centrífuga 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>Contando Lâminas Câmara Dupla</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>contagem de células</td></tr><tr><td>Sonifier Digital 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>veículo</td></tr><tr><td>DMEM Alta Glicose</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>meio de cultura</td></tr><tr><td>DMEM sem Fenol Vermelho</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>meio de cultura</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>um material para solução A68</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>versão 16.16.27</td><td>análise satisfatória</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Referência nº 24</td><td>versão 1.68</td><td>análise satisfatória</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>Meio de cultura</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>Ferramenta de análise de imagem</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>um material para solução tampão de amostra</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>um material para solução DAB</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>limpeza lenço</td></tr> de <tr><td>baixa retenção Tubo de baixa retenção</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA e transfecção de DNA</td></tr><tr><td>LSM780 Microscópio a laser confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-LC3 Anticorpo</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>1º anticorpo para immunoblotting</td></tr><tr><td>Cloreto de Níquel (II) Hexahidratado</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>um material para solução DAB</td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina Sal de Sódio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Meio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>siRNA e transfecção de DNA</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>Meio de cultura</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-PCNA</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1º anticorpo para imunoblotting</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Anticorpo</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>1º anticorpo para immunoblotting</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Anticorpo</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>1º anticorpo para immunoblotting</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-ULK1</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>1º anticorpo para immunoblotting</td></tr><tr><td>Polyvinylidene Difluoride Membrana</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>um material para immunoblotting</td></tr><tr><td>R</td><td>R desenvolvimento equipe principal</td><td>versão 4.4.1</td><td>análise satisfatória</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA reagente de transfecção</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>HSS115604 siRNA para transfecção</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>um material para tampão Tris e solução A68</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>um material para solução tampão de amostra</td></tr><tr><td>SPARK Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>transfecção de siRNA</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>um material para solução A68</td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado com impressora térmica</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>contagem de células</td></tr><tr><td>Thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>incubação</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>Reagente de transfecção de DNA</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>reagente</td></tr> <tr><td>de transfecção de DNATris(hidroximetil)aminometano</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>um material para tampão Tris, tampão de amostra e solução A68</td></tr><tr><td>Corante Azul de Tripano 0.40%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>contagem de células</td></tr><tr><td>Tubo Aberto Ultra-Clear, 16 x 96mm&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>coleta para a fração P1 EV</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>coleta para a fração P2</td></tr><tr><td>EV Kit Padrão Vectastain ABC</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>Garrafa de lavagem de PK-4000</td><td>immunoblotting</td></tr> como um <tr><td>ibidi</td> alto <td>80806</td><td></td> <td>do poço da lavagem do membrane&mu;-Slide 8</td></tr> da <tr><td></td><td></td><td>lavagem</td> <td>1-4640-02</td></tr></tbody></table>

avaliação da liberação de lc3-ii via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para lc3

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

Como mostrado em estudos anteriores, o tratamento com Baf aumentou os níveis de TSG101 (P1: P &lt; 0,01, P2: P = 0,012, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19) e LC3-II (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19) na fração rica em EV. Notavelmente, o tratamento com Baf também aumentou os níveis de STX6 (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19) na fração EV (Figura 1A), sugerindo que STX6 pode ser um componente de EVs. O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) não foi observado na fração EV. O immunoblotting de STX6 na fração celular revelou que os níveis de STX6 diminuíram pela metade com seu knockdown de siRNA (Figura 1B). O knockdown de STX6 não afetou os níveis de TSG101 nas frações celular e EV em condições tratadas com veículo e Baf (Figura 1C). No entanto, o knockdown de STX6 aumentou os níveis de LC3-II na fração celular sob a condição tratada com veículo, mas não sob a condição tratada com Baf. O knockdown de STX6 também aumentou os níveis de LC3-II na fração EV sob a condição tratada com Baf (Figura 1D). Esses achados sugerem que os métodos usados para detectar LC3-II em EVs por immunoblotting são suficientemente sensíveis, mesmo que a eficiência de knockdown não seja substancial. Além disso, esses resultados indicam que o knockdown de STX6 aumenta o número de autofagossomos intracelulares e aumenta a liberação extracelular de vesículas associadas a autofagossomos sob tratamento com Baf.
Para investigar ainda mais se o knockdown de STX6 influencia os números intracelulares de autofagossomos e autolisossomos, autofagossomos e lisossomos foram visualizados usando o marcador de autofagossomo mCherry-LC3 e o marcador de lisossomo LAMP1-GFP. A imagem confocal de células vivas revelou vesículas positivas para GFP e mCherry em células HeLa expressando LAMP1-GFP e mCherry-LC3 (Figura 2A). Os autolisossomos foram identificados como vesículas positivas para GFP e mCherry, enquanto os autofagossomos foram identificados como vesículas positivas para GFP e mCherry. O knockdown de STX6 aumentou o número de autofagossomos e autolisossomos sob a condição tratada pelo veículo ( Figura 2B , C ). No entanto, o knockdown de STX6 não afetou os números de autofagossomos e autolisossomos sob a condição tratada com Baf ( Figura 2B , C ).
Para determinar se o aumento no número de autofagossomos intracelulares devido ao knockdown de STX6 resultou do aumento da formação de autofagossomos, a formação de ômegassomos, um processo necessário para a formação de autofagossomos, foi examinada usando o marcador de ômegassomo GFP-ATG13 intensidade do sinal. A imagem confocal de células vivas forneceu uma imagem montada de GFP-ATG13, indicando a formação de ômegassomos (Figura 3A). O knockdown de STX6 diminuiu a intensidade do sinal GFP-ATG13 (P = 0,023, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR19). Embora o knockdown do STX6 não tenha influenciado significativamente a intensidade do sinal GFP-ATG13 sob a condição tratada pelo veículo, ele diminuiu significativamente o sinal sob as condições tratadas com Baf (Figura 3B). Coletivamente, esses achados indicam que o knockdown de STX6 aumenta a liberação de vesículas positivas para LC3-II ligadas ao acúmulo de vesículas associadas ao autofagossomo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
Figura 1: Resultados de immunoblotting das frações celulares, P1 e P2 de células HeLa transfectadas com siRNA controle ou STX6 sob tratamento com veículo ou Baf. As células HeLa foram tratadas com veículo (DMSO) ou 100 nM Baf por 24 h após a transfecção com controle ou siRNA STX6 . As frações célula, P1 (pellet de 20.000 × g ) e P2 (pellet de 110.000 × g ) foram isoladas. (A) Imagens representativas de immunoblotting de cada fração mostrando STX6, TSG101, LC3 e PCNA. (BD) A análise densitométrica para (B) STX6, (C) TSG101 e (D) LC3-II foi realizada a partir das imagens de immunoblot. As intensidades de sinal foram normalizadas para as células controle ou transfectadas por siRNA STX6 tratadas com veículo ou Baf. Os gráficos de barras representam valores médios ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0,05 por um teste t não pareado bicaudal no Excel. Abreviaturas: STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsulfóxido; TSG101 = gene 101 de suscetibilidade tumoral; LC3 = proteínas associadas aos microtúbulos 1A/1B de cadeia leve 3B; PCNA = antígeno nuclear de proliferação celular; S.E.M. = erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
Figura 2: Análise de imagem confocal de células HeLa co-expressando Lamp1-GFP e mCherry-LC3 transfectadas com controle ou siRNA STX6 sob a condição tratada com veículo e Baf. (A) Imagens confocais de células HeLa expressando de forma estável LAMP1-GFP e mCherry-LC3 foram transfectadas com controle ou siRNA STX6 por 48 h, seguidas de exposição a DMSO ou 400 nM Baf por 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B,C) A qunatificação de (B) autofagossomos (pontos negativos LAMP1-GFP e positivos mCherry-LC3) e (C) autolisossomos (pontos duplo-positivos LAMP1-GFP e mCherry-LC3) foi realizada usando o software Fiji. Os dados nos gráficos de barras são apresentados como valores médios ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0,05, com base em um teste t não pareado bicaudal no Excel. Abreviaturas: Lamp1 = proteína de membrana 1 associada a lisossomos; LC3 = proteínas associadas aos microtúbulos 1A/1B de cadeia leve 3B; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicina A1; GFP = proteína fluorescente verde; S.E.M. = erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
Figura 3: Imagem confocal de células HeLa expressando GFP-ATG13, transfectadas com siRNA controle ou STX6 e submetidas a tratamento com veículo ou Baf. (A) As células HeLa foram transfectadas com controle ou siRNA STX6 , seguidas de transfecção pEGFP-C1-hAtg13 e tratadas com DMSO ou 400 nM Baf por 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B) As intensidades relativas do sinal foram determinadas normalizando o sinal em cada condição para o das células transfectadas com siRNA de controle tratadas com Baf. O gráfico de barras mostra os dados como médias ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0,05 pelo teste t não pareado bicaudal no Excel. Abreviaturas: hAtg13 = gene 13 relacionado à autofagia humana; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsulfóxido; S.E.M. = erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura Suplementar S1: Análise de immunoblot das frações celulares, P1 e P2 de células HeLa transfectadas com siRNA controle e tratadas com Baf. As células HeLa foram transfectadas com siRNA controle e expostas a 100 nM de Baf por 24 h. Em seguida, foram preparadas frações: célula, P1 (pellet de 20.000 × g ) e P2 (pellet de 110.000 × g ). Imagens representativas de immunoblot de ULK1 e PCNA, mostrando seus níveis em cada fração para comparação. Abreviaturas: Baf = bafilomicina A1; ULK1 = unc-51 como quinase ativadora de autofagia 1; PCNA = antígeno nuclear de células em proliferação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

evaluation-lc3-ii-release-via-extracellular-vesicles-relation-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

A inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) mediada por AlPcS2a é uma ferramenta poderosa para estudar danos espaço-temporais de vesículas intracelulares (IVs) em células vivas.

Uma abordagem fotodinâmica no estudo da função da ruptura de vesículas intracelulares

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Explore como a autofagia regula a liberação de TDP-43 via vesículas extracelulares em células HeLa. Este método ajuda pesquisadores a identificar alvos terapêuticos para ELA e FTLD-TDP.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3 (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

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