Name: Marcação final fluorescente e encapsulamento de RNAs longos para microscopia FRET-TIRF de molécula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a marcação fluorescente dupla de RNAs longos e encapsulamento em vesículos fosfolipídicas para microscopia FRET-TIRF de molécula única. Este método permite visualizar dinâmicas de dobramento de RNA em tempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Marcação final de duas cores e encapsulamento de vesículas de RNAs para estudos smFRET-TIRF

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
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<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>marcação de RNA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp; Tubos de mL DNA LoBind&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC-HCl ou EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, formato sem peso. Armazenar em&nbsp; -20 & graus; C</td></tr><tr><td>3-morfolinopano-1-ácido sulfônico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, para biologia molecular, &ge; 99,5% (titulação)</td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,00063</td><td>100%, anidro para análise EMSURE ACS,ISO,Reag. </td></tr><tr><td>Unidade de filtração centrífuga Ph Eur&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu; L</td></tr><tr><td>Cianina 5 hidrazida (Cy5-hidrazida)</td> <td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, número CAS 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Etanol de grau de biologia molecular</td></tr><tr><td></td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absoluto &ge; 99,8%</td></tr> <tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>para biologia molecular, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>ácido clorídrico (HCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>1,00317</td><td>fumegante 37%, para análise EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>Acetato de sódio (NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>anidro, ReagentPlus, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Meta-periodato de sódio (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Linha de produtos</td></tr><tr><td>Pierce Sulfo-cianina3 amina (sCy3-amina)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, número CAS 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td><forte>Preparação da câmara</ forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil)trietoxissilano (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr> <tr><td>de acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>para análise EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotina-Polietilenoglicol-Succinimidil valerato (biotina-PEG-SVA, bPEG) e Metoxi polietilenoglicol-Succinimidil valerato (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5,000 e MPEG-SVA, MW 5,000 - Kit Combo</td></tr><tr><td>de Lamínulas</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0.13-0.16&nbsp; mm de espessura</td></tr><tr><td>Deconex 11 broca universal</td><td>Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Solução de limpeza de vidraria de laboratório</td></tr><tr><td>Broca de núcleo revestido de diamante</td><td>Corporação Crystalite 1</td><td></td><td>mm de espessura</td></tr><tr><td>Perfurador</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>diamante Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolute &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Frasco de coloração de vidro Coplin com tampa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espaçador de imagem</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 poços,&nbsp; 9&nbsp; mm e vezes; 0,12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Limpador de plasma de oxigênio</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>para biologia molecular, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Lâminas de quartzo</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5&nbsp; x&nbsp; 2.5&nbsp; cm, 1 mm de espessura</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99,5-100,5%</td></tr> <tr><td>< forte > preparação de bolo lipídico< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>16: 0 Biotinil Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinil) (sal de sódio), C53H98N4O11PNaS)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>Estável por 1 ano a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina ou 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2,0 mL, Autoclave Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>para esterilizar</td></tr><tr><td>500&nbsp; mL Schlenk frasco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>para análise EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imobilização de superfície via encapsulamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-morfolinopano-1-ácido sulfônico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, para biologia molecular, &ge; 99,5% (titulação). Armazene em +4 &deg; C no escuro.</td></tr><tr><td>Abas adesivas de vedação</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>de fígado bovino, suspensão aquosa, 10.000-40.000 unidades/mg de proteína</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge; 99,5% (GC), membrana de</td></tr><tr><td>policarbonato (PC) BioXtra Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0,1 &mu; m, 19 mm</td></tr><tr><td>Conjunto de extrusora com bloco de aquecimento</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>de Aspergillus niger, Tipo VII,&nbsp; pó liofilizado, &ge; 100.000 unidades/g sólido (sem adição de oxigênio)</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>para biologia molecular, 1,00 M &plusmn; 0,01 M solução</td></tr><tr><td>Disco de drenagem de poliéster (PE), membrana</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, para biologia molecular, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>para biologia molecular, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

marcação final fluorescente e encapsulamento de rnas longos para microscopia fret-tirf de molécula única

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Apresentamos a marcação fluorescente simples e dupla específica do local do RNA 915-nt de interesse, o íntron mitocondrial de levedura Sc.ai5γ grupo II, flanqueado por sequências exônicas. O par de fluoróforos FRET é posicionado nas extremidades do RNA por meio da ativação EDC / NHS do fosfato 5'-fosfato e oxidação periodato da 3'-ribose, seguida pelas respectivas ligações de corante. Em seguida, verificamos os conjugados RNA-corante por eletroforese em gel fluorescente, conforme apresentado na Figura 4A. A co-migração de RNA e fluoróforos no gel de agarose confirma a marcação bem-sucedida. Em seguida, conforme mostrado na Figura 4B, a espectroscopia de fluorescência de conjunto foi usada para caracterizar o íntron do grupo II duplamente marcado. A transferência de energia, ou seja, FRET, foi observada após a excitação do corante doador, comprovando a dupla marcação do RNA. Notavelmente, consistente com a natureza dependente da distância do FRET, o dobramento do RNA do íntron do grupo II na presença de íons metálicos levou a um aumento na eficiência do FRET, como evidenciado pela diminuição na emissão do doador (seta verde) e um aumento correspondente na emissão do aceptor (seta vermelha). Isso indica que essa marcação FRET rastreia as mudanças conformacionais da ribozima.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
Figura 4: Caracterização dos conjugados RNA-corante. (A) A análise analítica baseada em gel de RNA marcado com fluorescência simples e dupla mostra a co-migração dos corantes com o RNA em um gel de agarose a 2%. A co-localização dos fluoróforos na amostra duplamente marcada é indicada pela faixa amarela na imagem mesclada (inferior) dos canais Cy3 (superior, verde) e Cy5 (médio, vermelho), visualizados sob iluminação de 532 nm e 635 nm, respectivamente. Pista 1: 5'-sCy3 apenas RNA marcado, pista 2: 3'-Cy5 apenas RNA marcado e pista 3: RNA marcado com extremidade dupla (5'-sCy3 e 3'-Cy5). (B) A espectroscopia de fluorescência de conjunto confirma a marcação dupla. A transferência de energia após a excitação do doador (λex = 515 nm, λem = 670 nm) verifica se ambos os corantes são acoplados com sucesso ao RNA. A curva cinza representa o perfil de emissão do RNA pré-catalítico, enquanto a curva preta demonstra aumento da eficiência do FRET no RNA de íntron do grupo II dobrado (incubado com 500 mM KCl a 70 ° C por 3 min, resfriado a 42 ° C por 5 min, seguido pela adição de 100 mM MgCl2). Esta figura foi adaptada de Ahunbay et al.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Com o íntron do grupo II do tipo selvagem duplamente marcado com fluorescência em mãos, agora estamos posicionados para explorar sua dinâmica no nível de uma única molécula. Uma vez encapsulado em vesículas fosfolipídicas, o RNA marcado é imobilizado em uma superfície de microscopia em densidades superficiais muito baixas para atingir a resolução de molécula única para smFRET-TIRF. Como visto na Figura 5A, várias moléculas individuais podem ser rastreadas simultaneamente. A microscopia TIRF permite o monitoramento em tempo real da eficiência do FRET e suas mudanças ao longo do tempo. A Figura 5B exemplifica os traços estáticos e dinâmicos de FRET de molécula única do RNA marcado e encapsulado. Um traço dinâmico típico exibe anticorrelação entre sinais de doadores e aceitadores que flutuam na eficiência do FRET. Quando a emissão do aceptor após a excitação do doador aumenta, a emissão do doador diminui correspondentemente, indicando uma mudança dinâmica na distância entre corantes. Essa anticorrelação sugere mudanças conformacionais na molécula de RNA.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
Figura 5: Comportamento altamente dinâmico do RNA do íntron do grupo II revelado por smFRET. O RNA de íntron do grupo II marcado com extremidade dupla é encapsulado em uma vesícula fosfolipídica e imobilizado na superfície para imagens com um microscópio TIRF baseado em objetivo. (A) Imagem mesclada de moléculas de RNA marcadas individuais exibindo emissão de doadores (sCy3, verde) e emissão de aceptor (Cy5, vermelho) após excitação de 532 nm. (B) As trajetórias típicas de smFRET de (esquerda) uma molécula de RNA estática onde as intensidades do doador e do aceptor não flutuam ao longo do tempo e (direita) uma molécula de RNA dinâmica, onde as intensidades do doador e do aceitador se correlacionam, com eficiências de FRET em amarelo. Moléculas únicas são localizadas e analisadas usando MASH-FRET17. Correções de excitação direta, sangria e fator de γ são aplicadas. Abreviaturas: smFRET = Transferência de Energia de Ressonância de Förster de molécula única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Marcação final fluorescente e encapsulamento de RNAs longos para microscopia FRET-TIRF de molécula única

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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