Coloração viva/morta para quantificar células viáveis, mas não cultiváveis, em bactérias causadoras de feridas tratadas com mel de Manuka

Este projeto de pesquisa tem como objetivo investigar o impacto do mel de Manuka na fisiologia bacteriana. Estudos recentes forneceram mais informações sobre os efeitos antimicrobianos do mel de Manuka na fisiologia bacteriana. Nossas descobertas preliminares indicam que as bactérias do mel de Manuka entram no estado de dormência resistente a antibióticos, viável, mas não cultivável, mas em menor grau do que aquelas tratadas com antibióticos convencionais.

Com base em nossos experimentos, seria interessante comparar os perfis de expressão do mel de Manuka e dos VBNCs convencionais induzidos por antibióticos. Para começar, pegue os frascos contendo cepas bacterianas congeladas. Abra cada um sequencialmente e use um bastão estéril para raspar uma pequena quantidade de bactérias congeladas na placa de ágar Luria-Bertani ou LB devidamente rotulada.

Recoloque a tampa do frasco e coloque-a rapidamente no freezer. Incube as culturas bacterianas por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, use uma pipeta sorológica para transferir dois mililitros de caldo LB para dois tubos de ensaio estéreis.

Esterilize a alça de inoculação na chama do bico de Bunsen. Em seguida, transfira um quarto de laço de bactérias da placa de ágar LB para o tubo de ensaio devidamente rotulado contendo caldo LB. Incube o tubo de ensaio em condições aeróbicas em uma incubadora agitada a aproximadamente 250 RPM a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas.

Para a configuração do mel de Manuka e tratamentos antibióticos de bactérias, adicione 10 microlitros de cultura bacteriana a 10 mililitros de caldo Mueller Hinton para obter a diluição de 1:1.000 da cultura bacteriana, que tem aproximadamente 10 elevado à sexta colônia formando unidades por mililitro. Use as culturas diluídas para preparar três amostras para cada espécie bacteriana, um controle não tratado, uma amostra tratada com mel de Manuka e uma amostra tratada com antibióticos. Adicione o mel de Manuka e o antibiótico aos tubos apropriados.

Transfira 0,1 mililitro e 0,5 mililitros da amostra não tratada para tubos de microcentrífuga estéreis para a contagem de placas viáveis e a coloração viva/morta para o T é igual a zero amostras. Em seguida, incube o controle não tratado, o mel de Manuka tratado e as amostras tratadas com antibióticos em condições aeróbicas a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada a 250 RPM por 24 horas. Prepare uma diluição serial de dez vezes da amostra não tratada T igual a zero em caldo LB para obter um número contável de células para a contagem de placas viáveis.

Espalhe 50 microlitros de cada amostra diluída na metade de uma placa de ágar LB. Incubar as placas de ágar em condições aeróbicas a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, remova as placas de ágar LB da incubadora.

Identificar a placa de diluição que contém cerca de 25 a 150 colónias e contar o número exacto de colónias. Use a fórmula da unidade formadora de colônias para determinar o número de células cultiváveis por mililitro. No terceiro dia, adicione 0,5 mililitros de cloreto de sódio a 0,85% a 0,5 mililitros de T é igual a zero amostra de controle de coloração viva/morta não tratada.

Combine 1,5 microlitros de SYTO 9 e 1,5 microlitros de iodeto de propídio por amostra. Em seguida, adicione três microlitros da mistura a cada amostra. Incube as amostras a 21 graus Celsius no escuro por 15 minutos.

Transfira seis microlitros da amostra corada e suavemente misturada para um hemocitômetro descartável e visualize sob um microscópio fluorescente usando um filtro de isotiocianato de fluoresceína ou FITC e uma lente objetiva de 40X. Capture uma imagem mostrando as linhas da grade do hemocitômetro e as células verdes. Conte as células verdes em seis campos por amostra, observando as dimensões da grade para calcular o número de células verdes por volume.

Finalmente, calcule o número de células viáveis, mas não cultiváveis, subtraindo o número de células cultiváveis por mililitro obtido usando a contagem de placas viáveis do número de células viáveis por mililitro obtido usando coloração viva / morta. No quarto dia, após remover as culturas bacterianas não tratadas, tratadas com mel de Manuka e tratadas com antibióticos da incubadora, colete 0,1 mililitros e 0,5 mililitros de cada amostra em tubos de microcentrífuga para a contagem de placas viáveis e coloração viva / morta. Esta figura mostra o número de células cultiváveis e viáveis determinado usando a contagem de placas viáveis e coloração viva/morta para culturas de S. aureus e P. aeruginosa.

Os resultados mostram que o número de células viáveis e cultiváveis detectadas nas culturas não tratadas e tratadas com mel de Manuka não foram significativamente diferentes. As culturas de S. aureus tratadas com tobramicina apresentaram menos células cultiváveis do que células viáveis, mas essa diferença não foi significativa. Apenas P.aeruginosa tratada com meropenem apresentou uma redução estatisticamente significativa nas células cultiváveis em comparação com as células viáveis.