Fabricação e Rotulagem de Microbolhas com Traçadores Fluorescentes e Radioativos

As microbolhas são partículas suscetíveis ao ultrassom cheias de gás com recursos exclusivos de imagem e terapia do câncer. Suas utilidades em evolução podem ser estrategicamente avançadas com a construção de microbolhas rastreáveis orientadas por aplicativos. Nosso objetivo é facilitar esse objetivo desenvolvendo um protocolo de fabricação de microbolhas lipídicas que permita a geração personalizável de microbolhas não marcadas, radiomarcadas, fluorescentes e multimodais.

Alcançar uma rotulagem de rádio de microbolhas eficiente e estável é um desafio não trivial. As microbolhas lipídicas são frágeis e, portanto, sujeitá-las a etapas de calor, tempo e purificação em abordagens de marcação por rádio pós-fabricação pode perturbar suas propriedades físico-químicas e estabilidade. Por outro lado, a rotulagem de rádio pré-fabricação requer equipamentos especializados e maior exposição à radiação.

Superamos esses desafios desenvolvendo um novo protocolo híbrido no qual a quelação de radioisótopos ocorre antes da ativação das microbolhas, mas após a formação da suspensão lipídica. Essa abordagem de um pote pela primeira vez facilita a rotulagem de rádio de microbolhas de alta eficiência e sem purificação que preserva as propriedades físico-químicas das partículas. Uma vantagem adicional importante é a versatilidade dos protocolos. Pode ser incorporado durante a fabricação de microbolhas personalizadas e adaptado a suspensões lipídicas de microbolhas pré-formadas, como as disponíveis comercialmente. Ele pode ser aplicado com sucesso em diversas composições de lipídios e quelantes de microbolhas e, consequentemente, pode gerar microbolhas radioativas, fluorescentes ou trimodais personalizadas.

Juntas, essas propriedades permitem o rastreamento representativo multimodal de conchas lipídicas de microbolhas que podem promover insights mecanicistas e apoiar o avanço das terapias de ultrassom focadas em microbolhas em muitos domínios, incluindo estudo farmacocinético de microbolhas, imagens multimodais, planejamento de tratamento e habilitação de terapias sinérgicas.

[Narrador] Para começar a usar uma micropipeta, adicione um mililitro de solução AA-PGG ao longo das bordas do filme lipídico de microbolhas de escolha em um frasco, evitando a formação de bolhas. Cubra parcialmente a abertura do frasco com a tampa, deixando espaço suficiente para inserir a linha de perfluoropentano ou PFP. Flua o PFP para o headspace do frasco para injetáveis durante 20 segundos acima do líquido e tampe o frasco para injetáveis. Mergulhe a metade inferior do frasco para injetáveis em banho-maria a 70 a 80 graus Celsius por um minuto. Em seguida, sonicar o frasco para injetáveis durante 30 segundos em banhos de sonicador a 69 graus Celsius. Após a sonicação, limpe o frasco e deixe-o esfriar até a temperatura ambiente. Reabasteça o espaço livre do frasco para injetáveis com gás PFP. Em seguida, tampe o frasco e sele as bordas com Parafilm. Para configurar um banho-maria de 60 graus Celsius em um prato de cristalização, coloque uma barra de agitação magnética no prato e posicione-a em uma placa de agitação quente com temperatura controlada. Insira uma sonda térmica na água para monitorar a temperatura e ajustar a velocidade de agitação para criar um funil fraco, mas visível. Usando uma pinça, transfira um frasco lacrado contendo cobre 64 na forma de cloreto cúpico em ácido clorídrico normal 0,1 para um calibrador de dose. Registre a atividade de cobre 64 e o tempo. Usando uma pinça, remova o frasco do calibrador de dose e coloque-o em um recipiente com chumbo. Para calcular o valor em megabecquerels por mililitro, dividir a actividade anotada no calibrador de dose pelo volume de cobre 64. Destampe a suspensão lipídica e fixe-a num suporte para frascos. Em seguida, destampe o frasco de cobre 64, manuseando o frasco com uma pinça. Usando uma micropipeta, transfira um volume de solução de cobre 64 correspondente a 40 a 250 megabecquerels de atividade para a suspensão lipídica. Usando uma pinça com ponta de borracha plana, gire a suspensão lipídica radioativa para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para misturar o cobre 64 na suspensão. Enquanto o frasco estiver com o lado direito para cima, sacuda suavemente a tampa enquanto estabiliza o frasco. Com cuidado, destampe parcialmente o frasco e insira uma linha PFP equipada com agulha. Encha o headspace do frasco com PFP por 20 segundos. Em seguida, tampe e feche o frasco para injetáveis com parafilme. Meça a atividade do frasco usando um calibrador de dose e registre o tempo. Em seguida, coloque o frasco em um suporte de espuma para que a metade inferior do frasco fique exposta ao calor. Mergulhe o suporte no banho-maria de agitação de 60 graus Celsius e aqueça por uma hora. Enquanto isso, para preparar as tiras de iTLC, corte o papel de cromatografia de microfibra de vidro em tiras. Aqueça as tiras em um forno de secagem de vidro a 80 graus Celsius para ativar. Após uma hora, retire o frasco do banho-maria e limpe as bordas com papel de seda. Gire o frasco para cima e para baixo usando uma pinça com ponta de borracha. Enquanto o frasco para injetáveis estiver na posição vertical, sacuda a tampa enquanto estabiliza o frasco para injetáveis. Remova o parafilme e limpe ao redor da tampa para remover qualquer água presa. Localize um a dois microlitros da suspensão lipídica a um centímetro do centro inferior de uma tira iTLC ativada. Deixe o local secar. Usando uma micropipeta, adicione 200 microlitros de eluente iTLC no fundo de um tubo de ensaio de 10 mililitros. Aloje o tubo em um recipiente de chumbo. Adicione a tira de iTLC manchada ao tubo e deixe-a desenvolver-se até que o eluente atinja aproximadamente um centímetro do topo da tira. Em seguida, usando uma pinça, remova a tira revelada e segure-a verticalmente. Corte a tira em terços sobre tubos de plástico de cinco mililitros compatíveis com contador gama. Insira as tampas de pressão nos tubos. Meça a tira contendo tubos e um tubo de controle vazio usando um contador gama para detectar a atividade do cobre 64. Registre as contagens por minuto e subtraia a atividade do tubo de controle das outras leituras para corrigir a radiação de fundo. Em seguida, calcule a pureza radioquímica com base nas contagens corrigidas por minuto. Em seguida, destampe o frasco de suspensão lipídica marcada com rádio e adicione 8,89 microlitros de um hidróxido de sódio normal na suspensão. Depois de tampar e girar o frasco, bata suavemente no frasco para remover a suspensão presa no espaço da tampa e preencha o espaço da cabeça com gás PFP. Coloque o frasco em um agitador mecânico e ative-o por 45 segundos a 4.530 RPM para gerar uma suspensão de microbolhas leitosas. Após o resfriamento passivo à temperatura ambiente, inverta suavemente o frasco para injetáveis para ressuspender a suspensão de microbolhas. Coloque o frasco para injetáveis sobre uma superfície plana e aguarde dois minutos. Enquanto isso, equipe uma seringa de plástico de um mililitro com uma agulha de calibre 18 e ventile a seringa aspirando e mergulhando o ar para dentro e para fora. Após dois minutos, destampe o frasco rapidamente e retire 400 a 550 microlitros da suspensão do fundo do frasco. Limpe cuidadosamente as bordas da agulha e transfira a suspensão de microbolhas para um tubo de microcentrífuga. Depois de tampar o tubo, meça a atividade do produto final da microbolha em um calibrador de dose e anote o tempo. Dividir o valor da actividade pelo volume decantado para obter a actividade em megabecquerels por mililitro. Para começar, adicione 10 a 200 microlitros da suspensão de microbolhas a uma unidade de filtro centrífuga de corte de 0,5 mililitro e 30.000 pesos moleculares em um tubo de microcentrífuga compatível. Centrifugue a suspensão a 12.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use uma tesoura para cortar a conexão entre o tubo da microcentrífuga e sua tampa. Coloque a tampa em um frasco de cintilação de 20 mililitros rotulado CAPS. Transfira a unidade de filtro para um novo tubo de microcentrífuga identificado como TUBE 2. Coloque o primeiro tubo de microcentrífuga contendo infranadante em um frasco de cintilação de 20 mililitros rotulado como TUBO 1. Adicione 200 microlitros de água bidestilada à unidade de filtro no TUBO 2. Centrifugue a unidade de filtro novamente a 12.000 G por 10 minutos. Após a última transferência da unidade de filtro, adicione 200 microlitros de água destilada à unidade de filtro no TUBO 3 e centrifugue. Após a centrifugação, corte a tampa do tubo, adicionando-a ao frasco de cintilação da tampa e transfira a unidade de filtro para um novo frasco de cintilação de 20 mililitros rotulado como UNIT. Colocar o TUBE 3 num novo frasco para injetáveis de cintilação de vidro de 20 mililitros. Tampe os cinco frascos para injetáveis de cintilação e prepare um frasco para injetáveis de cintilação vazio e tampado como um controle em branco. Meça os seis frascos de cintilação em um contador gama para detectar a atividade do cobre 64. Subtraia o controle em branco das outras medições do frasco. Calcule a eficiência de rotulagem ou quelação de rádio.