Name: Fabricação e Rotulagem de Microbolhas com Traçadores Fluorescentes e Radioativos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a fabricar microbolhas lipídicas com rotulagem radioativa em um único passo, alcançando eficiência superior a 95% sem purificação. Este método preserva as propriedades físico-químicas das partículas para aplicações em imagem e terapia do câncer.

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Microbolhas são agentes teranósticos supramoleculares de tamanho mícron com um núcleo de gás estabilizado por uma proteína, polímero ou, na maioria dos casos, uma casca lipídica (Figura 1A). Quando injetadas na corrente sanguínea, as microbolhas mantêm interfaces gás/líquido que são detectáveis por ultrassom por períodos de minutos antes da dissolução de seus núcleos de gás 1,2. Consequentemente, o primeiro uso clínico das microbolhas foi como agentes de contraste de ultrassom em tempo real3. A invenção do ultrassom focalizado terapêutico (FUS) expandiu as utilidades clínicas de microbolhas. Quando estimuladas por FUS de baixa frequência, as microbolhas oscilam e geram forças mecânicas direcionadas e sintonizáveis que variam de permeabilização vascular transitória a ablação tecidual focal 4,5. Como resultado, nos últimos 20 anos, o FUS de microbolhas foi explorado para abertura da barreira hematoencefálica (BBB), administração de drogas tumorais (por exemplo, câncer metastático pancreático, cerebral e hepático), administração de sondas de imagem, terapia de doenças neurodegenerativas e ablação do câncer 6,7,8,9,10,11.
O arsenal teranóstico de microbolhas continua a avançar em novas e excitantes direções. As aplicações convencionais de entrega de microbolhas-FUS dependem da coadministração de carga terapêutica ou de imagem ao lado de microbolhas comerciais. Há um interesse crescente em aprimorar os recursos de entrega de microbolhas-FUS, entendendo as interações biológicas/casca de microbolhas, explorando formulações de microbolhas não comerciais personalizadas e gerando microbolhas teranósticas tudo-em-um com carga carregada diretamente no invólucro da microbolha 12,13,14. De fato, aproximadamente 40% dos estudos de liberação de medicamentos com microbolhas lipídicas fazem uso dessas microbolhas carregadas de concha15. Além da imagem e da administração de medicamentos, o microbubble-FUS também se mostrou promissor no aprimoramento da radioterapia contra o câncer16 e na ativação dos efeitos antineoplásicos de agentes benignos por meio da terapia sonodinâmica17,18.
Essas direções convencionais e expandidas em aplicações de câncer de microbolhas podem ser mais estrategicamente avançadas rotulando conchas de microbolhas com marcadores radioativos. No domínio das microbolhas carregadas de carga tudo-em-um, essa radiomarcação 1) facilita a avaliação quantitativa padrão-ouro da biodistribuição dentro e fora do alvo dessas conchas de microbolhas carregadas, 2) deriva relações farmacocinéticas de estrutura-atividade que informam a seleção ideal de composições de microbolhas para maximizar a entrega no alvo e 3) orienta a aplicação estratégica e apropriada guiada por imagem e o planejamento de tratamento (por exemplo, tipos de alvos de tecido, dosimetria, seleção de medicamentos para mitigar preocupações de segurança fora do alvo, utilidade em comparação com paradigmas convencionais de co-tratamento) de sistemas carregados de carga tudo-em-um15,19. Em um estágio pré-clínico, essa compreensão do destino da casca das microbolhas também pode iluminar mecanismos de ação mais amplos do microbolhas-FUS. Por exemplo, a transferência de lipídios de conchas de microbolhas para células-alvo demonstrou influenciar a sonoporação habilitada por FUS12,20. Compreender e otimizar essa transferência pode, portanto, informar as terapias pré-clínicas e clínicas de microbolhas-FUS nas quais a sonoporação está implicada (transfecção in vitro, administração de medicamentos, ablação de tumores, sensibilização à radiação e terapia sonodinâmica 20,21,22,23,24,25). As instalações duplas de ultrassom e radioimagem também permitiriam o monitoramento da abertura do vaso FUS e do tratamento (por exemplo, cinética de abertura da BHE) a partir de um único agente, em vez de projetos convencionais de agente duplo26. Na mesma linha, a radiomarcação de microbolhas lipídicas pode servir como uma alternativa completa de microbolhas-FUS/radioterapia de agente único às plataformas de co-entrega de microbolhas-FUS + radiofármacos27.
A fragilidade das microbolhas é um desafio não trivial para essa rotulagem. Todas as estratégias de radiomarcação existentes são limitadas por metodologias de purificação conhecidas por perturbar a estabilidade e o tamanho das microbolhas, enquanto algumas também apresentam radiomarcação ineficaz e instável 28,29,30,31,32. Os requisitos de purificação também levam a protocolos mais longos. Combinado com o uso de radioisótopos de vida curta (por exemplo, 18F t1/2 1,8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31), isso cria ineficiências relacionadas ao decaimento do radioisótopo e limita os prazos de radioimagem e planejamento de tratamento. Coletivamente, essas limitações correm o risco de aquisição de imagens de rádio encurtadas e não representativas, dados farmacocinéticos imprecisos e entrega ineficiente de radioisótopos tumorais.  
Neste relatório, essas limitações são superadas aproveitando as capacidades de quelação de metais fortes e estáveis da porfirina. As porfirinas são macromoléculas orgânicas e heterocíclicas com um anel planar altamente conjugado e um local de coordenação central que pode acomodar uma variedade de metais. Isso inclui radioisótopos de vida mais longa, como cobre-64 (t1/2 12,7 h), um radiofármaco com tomografia por emissão de pósitrons (PET) e viabilidade de contagem de γ33. Quando conjugadas a uma estrutura lipídica, as porfirinas podem ser prontamente incorporadas em estruturas supramoleculares e subsequentemente marcadas com cobre-64 com velocidade, alta eficiência de quelação e estabilidade sérica, mantendo as propriedades das partículas originais não marcadas33,34. Além disso, as porfirinas são fluorescentemente ativas com auto-extinção modular em nano e micropartículas que é restaurada após a ruptura das partículas; uma leitura complementar ao PET e à contagem de γ que facilita a análise do destino da concha em massa e microscópica (Figura 1A)15.
Ao usar porfirina-lipídio como quelante, essas propriedades foram exploradas para gerar uma nova metodologia de radiomarcação de microbolhas sem purificação (Figura 1B, C) que supera as limitações associadas aos métodos de radiomarcação de microbolhas existentes. Este protocolo atinge &gt;95% de eficiência de quelação de cobre-64, não requer purificação pós-rotulagem e preserva as propriedades físico-químicas das microbolhas. Ele pode ser facilmente integrado na fabricação "moída" de microbolhas lipídicas antes de sua ativação (Figura 1B). É versátil e pode ser aplicado com sucesso em formulações de microbolhas personalizadas e comerciais com diferentes comprimentos de cadeia lipídica de acila (C16 a C22), carga (neutra e aniônica) e composições lipídicas de porfirina (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%), gerando microbolhas com atividade de rádio e fluorescência. Sua adaptabilidade também pode se estender além da porfirina. O protocolo de um pote pode ser modificado para usar quelantes alternativos disponíveis comercialmente (por exemplo, dietilenotriamina pentaacetato (DTPA)-lipídio) e fluoróforos (por exemplo, DiI). Ele também pode ser modificado para rotular formulações de microbolhas pré-fabricadas por meio de uma abordagem de "pico". Assim, este método permite a produção de microbolhas personalizadas e rastreáveis (rádio, fluorescentes ou rádio / fluorescente ativas duplas) úteis para o avanço de aplicações mecanicistas, de imagem e terapêuticas de microbolhas-FUS. O protocolo abaixo descreve a fabricação de microbolhas lipídicas, aplicação do protocolo de radiomarcação de um pote, radiomarcação necessária e caracterização de propriedades físico-químicas e possíveis modificações.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg"> 
Figura 1: Protocolo de fabricação e radiomarcação de microbolhas. (A) O lipídio porfirina, na forma de pirofeoforbida-a-lipídio, serve como um quelante multimodal dentro deste protocolo. Como um monômero quelatado a cobre-64 (i), possui recursos de PET e imagem. Sua fluorescência é extinta na forma de partícula (microbolhas (ii) e sua nanoprogênie pós-dissolução (iii)) e não extinta com ruptura de partículas (iv). (B) Protocolo de hidratação/ativação do filme lipídico descrito neste relatório para gerar microbolhas lipídicas a partir do solo e (C) integração da radiomarcação de um pote entre a formação da suspensão lipídica e a ativação das microbolhas. Essa figura foi adaptada com permissão de Rajora et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>Escola de Medicina da Universidade de Washington, Instituto Mallinckrodt de Radiologia</td><td>N/A</td><td>Pedido em pequeno volume (< 10 &micro; L) dissolvido em ácido acético HCl 0,1 N</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>&ge; 95% de pureza</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Pureza: &ge; 98%</td></tr><tr><td>Equilíbrio - analítico</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Capaz de medir até 0,1 mg</td></tr><tr><td>Sonicador de banho</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Pode ser aquecido a 69 oC</td></tr><tr><td>Abertura CC - 30 mícrons</td><td>Beckman Coulter</td><td>A36391</td><td>Faixa de diâmetro de partícula: 0,6-18 um</td></tr><tr><td>eletrólito CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td>Diluente Isoton II</td></tr><tr><td>Software CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro de centrífuga (0,5 mL 30.000 MWCO) com tubos de microcentrífuga compatíveis</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0,5 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga - 15 mL com tampas</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Pureza: &ge; 99,8%&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de relhas</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e Coulter</td></tr><tr><td>Counter Cover slips</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR micro cover glass</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Certifique-se de que não oxidou</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes- quartos, 1 cm de comprimento de caminho</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes - 10 mL de plástico para medições CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A35471</td><td>Coulter Counter Accuvette ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Pode ser obtida através de um sistema de purificação de água ultrapura</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Perclorato de Tetrametilindocarbocianina)</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Forma de pó</td></tr><tr><td>Calibrador de dose</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Capaz de ler cobre-64</td></tr><tr><td>DPPA (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (sal de sódio)))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>Pó forma</td></tr><tr><td>DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>Pó forma</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-5000] (sal de amônio))Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>Forma</td></tr> <tr><td>de póDTPA-lipídeo (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilenotriaminapentaacético ácido (sal de amônio))Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>Forma em pó</td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador gama</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Capaz de ler cobre-64</td></tr><tr><td>Tubo de contagem gama tampas de empurrar</td><td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>Flangeado tampas de plugue para tubos de 12 mm</td></tr><tr><td>Tubos de contagem gama</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>Copo de vidro - 250 mL</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Capaz de suportar temperaturas de até 100 oC</td></tr><tr><td>Forno de secagem de vidro</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Pode ser aquecido a 80 oC</td></tr><tr><td>Seringas de microlitros de vidro - 25, 50, 100, 1000 &micro; L</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Compatível com solventes orgânicos</td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de vidro - 20 mL</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg; Frascos de cintilação, vidro borosilicato, com tampas de rosca, com forro de folha de celulose</td></tr><tr><td>Frascos de vidro - 0,5 dram</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR frasco de 1/2 dram, com tampa de rosca fenólica preta e revestimento de polpa de polivinil</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td>Pureza:&nbsp; &ge; 99.0%&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta/pistola graduada</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> quente/agitadora <td>Equipada com sonda de temperatura para controle automático de temperatura</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico - 0,1 N</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas iTLC</td><td>Agilent</td><td>A120B12</td><td>&nbsp; Papel para cromatografia iTLC-SA</td></tr><tr><td>Tecidos de laboratório</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtração a vácuo de mídia</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Tamanho de poro de 0,22 mícron, membrana PES, capacidade de funil de 500 mL</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Pureza:&nbsp; &ge; 99,8%, grau HPLC, atende às especificações ACS</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga não estéreis - 1,5 mL</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estéreis - 1,5 mL</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas - p1000, p200, p20, p10</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Certifique-se de que estão calibradas</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio Agulhas pré-limpas</td></tr><tr><td>- 18 G</td><td></td><td></td><td>Parafilme estéril</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS, modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>Pureza:&nbsp; &ge; 99.8%</td></tr><tr><td>Linha PFP</td><td>Qualquer empresa</td><td></td> de <td>mangueira de plástico de 1/4 de polegada cortada cerca de 50 cm de comprimento</td></tr><tr><td>Regulador PFP</td><td>Swagelok</td><td>SS-1RF4 e SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Padrões de pH 4 e 7</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta para p1000, p200, p10 - não estéril</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta para p1000, p200, p10 - estéreis</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de plástico - 1 mL</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Propilenoglicol</td><td>BioShop</td><td>PRO888.500</td><td>Pureza:&nbsp; &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>Pyro-lipid</td><td>N/A</td><td></td><td>Feito internamente</td></tr><tr><td>Pinça com ponta de borracha</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Mistura de pontas finas e bordas planas/quadradas recomendadas</td></tr><tr><td>Tesouras</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio - 1 N</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio - 10 N</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Capaz de excitação de 410 nm e emissão de 600-850 nm Software de</td></tr><tr><td>espectrofluorometria</td><td>Espectrômetro Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa - 1 mL</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Descartável, plástico, estéril</td></tr><tr><td>Filtros de seringa - tamanho de poro de 0,2 mícron</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Material da membrana: PES ou outro compatível com acetato de amônio/ácido acético e PBS</td></tr><tr><td>Tubo de ensaio - 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessecador/vácuo a vácuo</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>Referido no protocolo como um agitador mecânico de frascos</td></tr><tr><td>Pesar papel</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td>Para evitar a perda de produto, recomenda-se cortar o papel de pesagem em quadrados de 3x3 cm</td></tr></tbody></table>

fabricação e rotulagem de microbolhas com traçadores fluorescentes e radioativos

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

Os principais resultados quantificáveis ao fabricar microbolhas radiomarcadas são a pureza radioquímica e a eficiência da radiomarcação. Este protocolo usa iTLC e um procedimento centrífugo validado, respectivamente, para caracterizar cada um. A Figura 2A mostra que as purezas e eficiências radioquímicas médias de ≥95% foram alcançadas em formulações comerciais que imitam microbolhas nas quais o lipídio do hospedeiro foi substituído por pirolipídio em composições de 1 mol%, 10 mol% ou 30 mol...

Fabricação e Rotulagem de Microbolhas com Traçadores Fluorescentes e Radioativos

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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