Name: Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a diferenciar células NK CAR derivadas de iPSCs humanos para imunoterapia antitumoral. Este protocolo utiliza integração gênica não viral e CRISPR-Cas9 para melhorar a persistência in vivo e a eficácia contra tumores sólidos.

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<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>Laboratório Dean A. Lee&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>meio de cultura a-MEM&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-anti-humano TRA-1-81&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Detecção Verde Caspase-3/7 CellEvent&nbsp;</td><td>Pescador térmico</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Proliferação de Células Violetas CellTrace&nbsp;</td><td>Pescador térmico</td><td>Cat#C34571</td><td>Corante fluorescente de rastreamento celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução CryoStor&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>Meio de criopreservação</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander Medium</td><td>Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Enriquecimento de Células NK Humanas EasySep</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#19055</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#555888</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#555029</td><td></td></tr><tr><td>GolgiStop&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX Suplemento Gibco</td><td></td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat#16050130</td><td></td></tr><tr><td>Soro Humano&nbsp;</td>Kit de Nucleofector de Células-Tronco <td>Humanas AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lonza&nbsp;</td><td>Cat# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células HePG2</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Gato#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células HePG2-td-tomate-luc&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Humano: células iPS&nbsp;</td><td>Laboratório de Dan S. Kaufman&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células SNU-449</td><td>ATCC</td><td>Cat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células SNU-449-td-tomato-luc&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay&nbsp;</td><td>Essenbiociência&nbsp;</td><td>Cat#4440</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-Ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; Soro Humano, Tipo AB</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR mais</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress software&nbsp;</td><td>ACEA Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 anti-humano SSEA-4 Anticorpo&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Gato#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ligante PE-FAS&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Casaco buffy de sangue periférico</td><td>Banco de Sangue de San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PE-TRAIL&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>Laboratório Branden Moriarity&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMAX-GFP plasmídeo</td><td>Lonza</td><td>N/A</td><td>GFP controle positivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad&nbsp;</td><td>Versão 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano bFGF basic&nbsp;</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>Ligante FLT-3 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19 IL-15</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>IL-3 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Nodal Humana Recombinante</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>SCF humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>TGF Humano Recombinante-&beta; 1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Médio</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>5270</td><td>EB formação média</td></tr><tr><td>STEMdiff APEL2 Medium&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac Vetor de expressão de transposase</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced Kit de coloração de células mortas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Kit de solução de coloração de células mortas</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Diagrama esquemático da diferenciação e expansão de células NK derivadas de iPSC anti-GPC3-CAR O diagrama esquemático ilustra a diferenciação in vitro de células NK projetadas anti-GPC3-CAR derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e uma representação esquemática do vetor piggyBac carregando a construção GPC3 CAR. Inicialmente, as iPSCs não modificadas são transfectadas com um vetor piggyBac que codifica o GPC3 CAR (receptor de antígeno quimérico). Após a transfe...

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Descrevemos um protocolo de transfecção para a produção de células assassinas naturais do receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) direcionadas a patógenos fúngicos usando o sistema de transposon não viral da Bela Adormecida. Para avaliar a ativação específica do antígeno, co-cultivamos as células modificadas com tubos germinativos de Aspergillus fumigatus e medimos a secreção de IFN-γ.

Engenharia de Células Assassinas Naturais do Receptor de Antígeno Quimérico Direcionadas a Infecções Fúngicas Usando o Sistema de Transposon da Bela Adormecida Não Viral

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Aprenda a diferenciar células NK CAR derivadas de iPSCs humanos para imunoterapia antitumoral. Este protocolo utiliza integração gênica não viral e CRISPR-Cas9 para melhorar a persistência in vivo e a eficácia contra tumores sólidos.

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco (Vídeo) | JoVE Journal

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

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