Respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume

Neste estudo, queremos investigar se a câmara de pequeno volume calibrada para 0,5 mililitro pode ser utilizada em ensaios respirométricos sem comprometer a precisão obtida para o volume clássico de dois mililitros na plataforma Oroboros.

Nosso desenvolvimento da câmara de pequeno volume e avaliação por respirometria de alta resolução com rigoroso controle de qualidade usando análise de precisão OXPHOS abriu caminho para desenvolvimentos, novas inovações, ou seja, número um, um respirômetro O2k de 12 câmaras, número dois, um robô para titulações automáticas de substâncias em protocolos complexos aplicados para análise OXPHOS. Essas aplicações serão cruciais para expandir ainda mais a análise mitocondrial, diagnóstico de doenças mitocondriais, avaliação do desenvolvimento de medicamentos com foco nos benefícios dos medicamentos para a função mitocondrial e nos efeitos fora do alvo que interrompem a função mitocondrial involuntariamente. Quando minha equipe desenvolveu a respirometria de alta resolução há mais de 30 anos, havia um paradigma de que mitocôndrias, mitocôndrias, mitocôndrias. Talvez houvesse uma diferença entre as mitocôndrias musculares e hepáticas, mas era isso. Ninguém estava realmente interessado em mitocôndrias fora desses paradigmas. Com nossos protocolos desenvolvidos para respirometria de alta resolução, mostramos uma enorme diversidade de função mitocondrial. Isso nos permite avaliar o controle respiratório mitocondrial em diversos tipos de células, tecidos e espécies com um novo olho. Há 30 anos, havia cerca de 10 publicações apreciando isso. Agora, temos com nosso instrumento mais de 1.500 usando esses protocolos.

Quatro vezes menos amostra é necessária na câmara de pequeno volume em comparação com a câmara clássica de dois mililitros. No caso de amostra com baixas frequências respiratórias, a mesma quantidade de amostra pode ser usada para aumentar os fluxos de oxigênio específicos do volume para reduzir a incerteza da medição.

O foco do nosso trabalho no Laboratório de P&D da Oroboros é combinar desenvolvimento instrumental e pesquisa acadêmica. Avaliamos a função respiratória mitocondrial e os perfis biogenéticos com análise multissensor. Isso está medindo a respiração, os potenciais redox, o potencial de membrana, a absorção de cálcio, a produção de peróxido de hidrogênio e vários outros parâmetros que nos permitem ter uma visão mais profunda do perfil biogenético e da função e disfunção mitocondrial.

[Narrador] Para começar, monte o Small Volume, ou câmara SV, no Oroboros. Em seguida, ligue o Oroboros e clique em Conectar para conectar o Oroboros ao software DatLab. Depois de secar completamente as câmaras, use uma pipeta para adicionar 0,54 mililitros de água na câmara SV. Em seguida, ligue os agitadores. Antes de fechar a câmara, humedecer os anéis de vedação das rolhas, mantendo o capilar seco. Afrouxe o anel de calibração de volume e, em seguida, insira a rolha para baixo até que o líquido encha o capilar da rolha e um menisco se forme no recipiente na extremidade superior do capilar. Aperte o anel de calibração de volume para garantir sua posição, garantindo a consistência do volume calibrado para inserções consecutivas. Para começar, encha as câmaras com o meio respiratório MiR05 Inicie o software DatLab. Selecione o protocolo apropriado para o teste de fundo instrumental. Defina a velocidade de rotação de agitação para 550 RPM, o volume da câmara para 0,5 mililitros, o intervalo de registro de dados em dois segundos e a temperatura experimental para 37 graus Celsius. Execute o teste do agitador e a calibração do ar. Defina a marca R1 no gráfico de concentração de oxigênio movendo o cursor enquanto mantém pressionada a tecla Shift. Ocasionalmente, realize calibrações de oxigênio zero. Durante a calibração do ar, prepare uma solução reserva de ditionito de sódio fresca dissolvendo o pó de O2-Zero em tampão fosfato 50 milimolar a uma concentração de 2,5 milimolares para o SV. Depois de concluir a calibração do ar, feche a câmara. Monitore o sinal de oxigênio por aproximadamente 60 a 120 minutos, permitindo que a concentração de oxigênio diminua da saturação do ar para cerca de 150 micromolares. Defina quatro marcas rotuladas de J01 a J04 no gráfico negativo de inclinação de oxigênio. Opcionalmente, usando uma seringa Hamilton, titular a solução de ditionito de sódio para ajustar a concentração de oxigênio para 100 micromolares e definir a marca J05. Para calcular a inclinação de fundo do oxigênio instrumental no DatLab, selecione Flux Slope. Em seguida, abra a janela de correção de fundo de oxigênio e selecione Arquivo ativo como a fonte dos dados de fundo de oxigênio. Verifique se todas as marcas J0 são usadas para o cálculo da regressão linear. Em seguida, clique em Aplicar para a correção do plano de fundo do oxigênio. Para começar, lave as câmaras Oroboros com água deionizada e adicione meio MiR05 fresco na câmara. Após o teste de fundo instrumental, abra uma nova guia DatLab e selecione o protocolo SUIT-003 para experimentos com plaquetas humanas. Usando a visão geral do protocolo DatLab que aparece na barra lateral do protocolo, selecione as soluções de estoque de produtos químicos. Em seguida, selecione as seringas Hamilton de acordo com os produtos químicos. Coloque as seringas no suporte de seringas com etiquetas em sequência de acordo com o protocolo SUIT. Para a reposição parcial do volume, calcular o volume V in equivalente ao volume V out retirado do volume real na câmara aberta, tendo em conta o volume morto capilar. Em seguida, remova a rolha totalmente inserida e coloque-a no rack. Remover o volume calculado V do MiR05 da câmara com base no tipo de célula e na concentração da suspensão da célula de reserva. Agora, pipete um volume equivalente da suspensão de células de estoque com uma concentração de células conhecida na câmara. Em contraste, para substituição completa do volume, sifão todo o meio da câmara. Adicione 0,54 mililitros do estoque de mitocôndrias cardíacas isoladas à câmara SV. Feche a câmara e retire o excesso de solução de amostra do recipiente de rolha. Para iniciar um protocolo de Titulação do Inibidor do Desacoplador de Substrato, ou SUIT, abra a janela Evento no DatLab para visualizar os volumes de titulação. Usando a microseringa Hamilton, titular as soluções de estoque de produtos químicos na câmara. Em seguida, defina o evento no DatLab. Permitir a estabilização do fluxo após a titulação. Para análise de dados, defina uma marca na parte representativa e estável do gráfico. O fluxo de oxigênio de fundo na saturação do ar foi 3,9 vezes maior na câmara de 0,5 mililitro em comparação com a câmara de 2,0 mililitros, consistente com a diferença de quatro vezes teoricamente esperada no fluxo de oxigênio de fundo específico do volume. A variabilidade dos fluxos instrumentais de fundo foi quase idêntica nos dois volumes de câmara. As taxas respiratórias de plaquetas vivas, fibroblastos permeabilizados e mitocôndrias isoladas foram intimamente correlacionadas em ambos os tipos de câmara quando a correção de fundo apropriada foi aplicada. O fluxo de oxigênio estabilizou-se mais rapidamente na câmara de dois mililitros do que na câmara de 0,5 mililitro pós-reoxigenação. O consumo residual de oxigênio pós-inibição do Complexo III foi consistente entre as duas câmaras, alinhando-se com o limite de detecção instrumental.