Name: Respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda respirometria de alta resolução em câmara de 0,5 mL para análise da função mitocondrial com menor volume amostral. Este método validado expande pesquisas em diagnóstico de doenças e desenvolvimento de fármacos.

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Para o estudo em plaquetas humanas, oito voluntários forneceram consentimento informado por escrito para participar do estudo, que foi aprovado pela Autoridade Sueca de Revisão Ética (nº 2013/181). Duas linhagens celulares de fibroblastos de pele humana de recém-nascidos do sexo masculino foram adquiridas da ATCC e usadas de acordo com a aprovação ética do Ministério da Saúde da República Tcheca (projeto: AZV MZ CR NU22-07-00474). Os procedimentos envolvendo camundongos foram conduzidos de acordo com a Lei Austríaca de Experimentação Animal e em conformidade com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais Vertebrados usados para Fins Experimentais e outros Fins Científicos (Tierversuchsgesetz 2012; Diretiva 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). O princípio dos 3Rs foi aplicado para minimizar o número de animais experimentais.
1. Calibração de volume
<ol>
	<li>Monte as câmaras de pequeno volume (sV) ou as câmaras de volume clássico (cV) no Oroboros (Figura 1A, B; Tabela 1).</li>
	<li>Ligue o Oroboros e conecte-se ao DatLab.</li>
	<li>Seque as câmaras.</li>
	<li>Pipete 0,54 mL de H2O no sV (0,50 mL de volume experimental efetivo mais 0,04 mL de volume morto capilar) ou 2,07 mL de H2O no cV (2,00 mL de volume efetivo mais 0,07 mL de volume morto capilar). NOTA: Para evitar a perda de líquido entre a parte superior do cilindro de vidro e o suporte da câmara de polioximetileno (POM), insira a ponta da pipeta com profundidade suficiente para tocar a parede da câmara de vidro.</li>
	<li>Ligue os agitadores.</li>
	<li>Antes de fechar a câmara, humedeça os anéis de vedação das rolhas, mantendo o capilar seco. Soltar os anéis de calibração do volume e introduzir as rolhas para baixo até que o líquido encha o capilar da rolha e apareça uma pequena gota no recipiente na extremidade superior do capilar (quadro 1).</li>
	<li>Apertar os anéis de calibração do volume para fixar a sua posição de modo a que o volume calibrado seja obtido em inserções consecutivas dos batentes.</li>
</ol>
2. Configuração geral do Oroboros
<ol>
	<li>Inicie o software DatLab .</li>
	<li>Regular a temperatura experimental (37 °C) e a velocidade de rotação de agitação a 550 rpm (9,2 Hz ou rotações por s) na câmara sV ou a 750 rpm (12,5 Hz) na câmara cV. Defina o intervalo de amostragem de dados em 2 s com suavização acima de 80 s (40 pontos de dados) em testes instrumentais de fundo O2 ou 40 s (20 pontos de dados) para respirometria. NOTA: As barras agitadoras magnéticas (AlNiCo revestidas com difluoreto de polivinilideno [PVDF]; Tabela 1) são agitados por um campo magnético rotativo pulsado com intensidade de campo de 3,5 mT ao nível do agitador na câmara.</li>
	<li>Efectuar a calibração do ar28 no MiR05 ou no mesmo meio de incubação utilizado nas experiências subsequentes.</li>
	<li>Realize calibrações de oxigênio zero ocasionalmente, mas nunca imediatamente antes de iniciar os experimentos.<ol>
		<li>Prepare uma solução reserva de Na-ditionita fresca dissolvendo o pó de O2-Zero em tampão fosfato 50 mM (pH 8,0) a uma concentração de 2,5 mM ou 10 mM paraas câmaras s V ou CV, respectivamente.</li>
		<li>Titular o excesso de Na-ditionite para obter o sinal bruto R0 ou a corrente nula [μA] na concentração de O2 0 μM14,28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Teste de fundo instrumental O2
<ol>
	<li>Câmara sV
	<ol>
		<li>Após a calibração do ar, feche a câmara. Monitore o sinal de oxigênio por cerca de 60 min até que a concentração de O2 diminua da saturação do ar para aproximadamente 150 μM. Defina quatro marcas J ° 1 a J ° 4 no gráfico 'O2 inclinação negativa'. NOTA: Execute este teste de fundo instrumental O2 todos os dias antes de iniciar um experimento.</li>
		<li>OPCIONAL: Com uma seringa Hamilton, titular a Na-ditionita preparada de acordo com o passo 2.4.1 para atingir uma concentração de O2 de 100 μM (Figura 1C). NOTA: Em outro protocolo, a Na-ditionita é titulada na câmara usando a microbomba de titulação-injeção (TIP2k; Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2) para comparação com um método padrão de determinação do fundo instrumental O2 fluxo28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Câmara cV
	<ol>
		<li>Após a calibração do ar, feche a câmara, aguarde a estabilização da inclinação de O2 e defina a marca J ° 1 na parcela 'O2 slope neg.'28. Com uma seringa de Hamilton, titular a Na-ditionite preparada de acordo com o passo 2.4.1. em passos de 0,7 μL para corresponder ao regime de oxigénio da Câmara sV e diminuir a concentração de O2 para 150 μM.</li>
		<li>Adicione outra etapa de titulação de Na-ditionita (ca. 7 μL) para diminuir a concentração de O2 para 100 μM ( Figura 1D ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise de dados de fundo instrumental O2<ol>
		<li>Calcule a inclinação de fundo instrumental de O2 no DatLab28. Selecione Fluxo/Inclinação no menu superior.</li>
		<li>Abra a janela de correção de fundo O2. Selecione Active File como fonte do fundo O2 e selecione as marcas J° a serem usadas para o cálculo da regressão linear. Aplique a correção de fundo O2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Câmaras de pequeno volume (sV) e volume clássico (cV) e teste de fundo instrumental O2. (A) Câmara sv. (B) Câmara cv. (C) Traços representativos de marcas de inclinação negativa e J ° 1, sV (0,5 mL; verde) e cV (2,0 mL; azul). (D) Concentração de oxigênio correspondente e marcas R1. Três titulações manuais de Na-ditionita (ca. 0,7 μL, estoque de 10 mM; cV) e titulação final de 7,0 μL de estoque de 2,5 mM e 10 mM na câmara sV e cV, respectivamente. Os picos causados pelas titulações foram eliminados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Adição de amostra às câmaras de Oroboros
NOTA: A amostra pode ser adicionada à câmara por dois métodos: reposição volêmica parcial (plaquetas e fibroblastos no presente estudo) ou reposição volêmica completa (mitocôndrias isoladas no presente estudo).
<ol>
	<li>Substituição parcial do volume<ol>
		<li>Remova a rolha totalmente inserida. Pipetar e rejeitar um volume Vdo MiR05. Asaída V é de 60-70 μL para plaquetas e 80-150 μL para fibroblastos, calculados de acordo com as concentrações celulares na suspensão de células de estoque.</li>
		<li>Equivalente a Vout, pipetar o mesmo volume VJ.i de suspensão de célula de estoque (com concentração de célula conhecida) na câmara (Figura 2).</li>
		<li>Calcule a concentração celular experimental no volume real V' (0,54 mL e 2,07 mL), maior que o volume experimental efetivo V (0,5 mL e 2,0 mL). NOTA: As concentrações da suspensão de células de reserva e a concentração de células experimentais devem ser planeadas para obter volumes de VJ.i = Vque sejam compatíveis com um pequeno erro de titulação. Nos experimentos com plaquetas, foi utilizado um protótipo de rolha para oV da Câmara com volume morto capilar de 0,05 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Substituição completa do volume<ol>
		<li>Extrair todo o meio da câmara e substituí-lo por pelo menos 0,54 mL ou 2,07 mL de solução estoque de mitocôndrias isolada na concentração experimental da amostranas câmaras s V ou CV, respectivamente.</li>
		<li>Feche a câmara e retire o excesso de solução de reserva mitocondrial do recipiente da rolha. NOTA: A reposição completa do volume exclui qualquer variabilidade na concentração mitocondrial que possa ocorrer ao titular para a câmara fechada através do capilar da rolha com uma seringa de Hamilton. Este último método é aplicável a amostras de pequeno diâmetro preparadas em suspensões concentradas (por exemplo, mitocôndrias isoladas); no entanto, expõe células frágeis a danos potenciais das membranas plasmáticas por forças de cisalhamento exercidas na agulha de 51 mm de comprimento da seringa Hamilton (0,41 mm de diâmetro interno). Isto é evitado removendo a rolha e pipetando a amostra para a câmara por substituição parcial ou total do volume. Três tipos de preparações mitocondriais foram estudados. As preparações de amostras são descritas no Arquivo Suplementar 1 1,26,29,30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Células vivas: plaquetas humanas<ol>
		<li>Introduzir os criotubos contendo plaquetas num banho-maria a 37 °C e descongelar o conteúdo até restar pouco gelo.</li>
		<li>Abra os criogeniais e adicione 1 mL de meio pré-aquecido (DPBS + 10 mM EGTA, 37 ° C) lentamente em gotas.</li>
		<li>Misture delicadamente as plaquetas e transfira-as para um tubo de centrifugação de 50 mL com um volume total de 10 mL de meio pré-aquecido (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugar a 1000 g durante 10 min à temperatura ambiente (RT) utilizando um rotor basculante (aceleração 6, travão 2).</li>
		<li>Ressuspenda as plaquetas em 0,25 mL de DPBS + 10 mM EGTA (RT) e adicione-as às câmaras por substituição parcial do volume para uma concentração inicial de células experimentais variando de 157 · 106 até 210 · 106 x·mL-1 na câmara de 0,5 mL e de 164 · 106 até 220 · 106 x·mL-1 na câmara de 2,0 mL (ver31 para detalhes sobre a unidade elementar x). NOTA: Um Oroboros foi equipado com as câmaras sV e cV nas posições A e B, respectivamente, utilizadas em paralelo com outro Oroboros equipado com as câmaras sV e cV nas posições B e A, respectivamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Células permeabilizadas: fibroblastos humanos<ol>
		<li>Adicionar as células às câmaras de Oroboros por substituição parcial do volume até uma concentração nominal de células de 0,75 · 106 x·mL-1 em ambos os tipos de câmara e calcular a concentração real (passo 4.1.3). NOTA: Diferentes instrumentos Oroboros foram usados em paralelo, cada um equipado com ascâmaras SV ou CV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mitocôndrias isoladas: coração de camundongo<ol>
		<li>Adicione 15 μL de suspensão mitocondrial a 5985 μL de meio respiratório mitocondrial (MiR05), resultando em uma concentração de proteína mitocondrial padrão variando de 0,013-0,026 mg∙mL-1.</li>
		<li>Adicione a suspensão mitocondrial às câmaras de Oroboros por substituição completa do volume. NOTA: Um Oroboros foi equipado com as câmaras sV e cV nas posições A e B, respectivamente, utilizadas em paralelo com outro Oroboros equipado com as câmaras sV e cV nas posições B e A, respectivamente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg"> 
Figura 2: Adição da suspensão celular por reposição parcial de volume. (A) Adição na Câmara de 0,5 mL sV e (B) na Câmara de 2,0 mL cV. (1) Câmara fechada com volumes de meio respiratório V e capilar de rolha cheio Vstc, para medição do fundo instrumental O2 fluxo JO2°. (2) Rolha removida, Vstc drenado para a câmara, resultando em volume total V'= V+Vstc. (3) Remoção parcial do meio Vout = -V J.i. Um volume V''= V'+Vde saída permanece na câmara. (4) Pipetagem de subamostra com volume V J.i de suspensão respirométrica de células de estoque na câmara, resultando em um volume total V# = V+Vstc de suspensão de células diluídas. (5) Câmara fechada com capilar de rolha cheia (volume morto Vstc) para medição do fluxo de O2 específico do volume JV,O 2 num volume experimental V. Esta figura foi modificada da Figura 2A em Contagem de células e normalização em HRR41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. Protocolos SUIT
<ol>
	<li>Titular as soluções-mãe dos produtos químicos listados na Tabela Suplementar 1 nas câmaras com microsseringas de Hamilton, ajustando os volumes de titulação para obter as mesmas concentrações experimentais nas câmaras sV e cV (ver legendas das figuras 6, 8, 10).</li>
	<li>Selecione o protocolo SUIT-003_D018 32,33 (para plaquetas no presente estudo).</li>
	<li>Selecione os protocolos SUIT-001_D004 4,15,34,35 e SUIT-002_D007 4,15,35,36 (para fibroblastos no presente estudo).</li>
	<li>Selecione o protocolo SUIT-002_D005 4,15,35,37 (para mitocôndrias isoladas no presente estudo).</li>
</ol>
6. Análise de dados SUIT
<ol>
	<li>No DatLab, defina marcas para definir seções de gráficos selecionados.</li>
	<li>Selecione Fluxo/Inclinação no menu superior. Abra a janela Fluxo/Inclinação . Aplicar a correção do volume de titulação para diluição de amostras suspensas por cada titulação no protocolo SUIT.</li>
	<li>Selecione Marcas no menu superior. Abra as estatísticas de marca para mostrar a mediana dos pontos de dados marcados corrigidos pela linha de base por subtração do consumo de oxigênio residual (rox).</li>
	<li>Calcular o intercepto e a inclinação entre os resultados pareados obtidos nas câmaras sV e cV por meio de análise de regressão invertida25,28 usando uma planilha.</li>
	<li>Comparar as freqüências respiratórias no estado rox (fluxos mínimos de O2) nas câmaras sV e cV por meio de um teste t de Student pareado usando o software jamovi 2.3.1338. NOTA: Como as duas câmaras em um instrumento Oroboros são funcionalmente independentes (exceto para temperatura e intervalos de gravação do DatLab), as medições em cada câmara podem ser consideradas separadamente, semelhante ao uso de instrumentos diferentes. Os resultados finais podem ser relatados como medianas ou médias de múltiplas câmaras com informações sobre sua variabilidade.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Explorando volumes de câmara para respirometria mitocondrial de alta resolução

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<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td> <td>software</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Alemanha</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos 100x</td><td>Biosera, França</td><td>XC-A4110</td><td>CUIDADO H317 Pode causar uma reação alérgica na pele</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>A8674</td><td>ATENÇÃO H300&nbsp; Fatal se ingerido, H400 perigo aquático de curto prazo (agudo)</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, EUA&</td><td>nbsp; A 2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA livre de ácidos graxos</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>A 6003</td><td>albumina de soro bovino</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>C2759</td><td>cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona CUIDADO H301 + H311 + H331 Tóxico se ingerido, em contato com a pele ou se inalado</td></tr><tr><td>Condessa Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>Versão 7.4</td><td>Software para aquisição e análise de dados</td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>Versão 8.1</td><td>Software para aquisição e análise de dados</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad, EUA</td><td>5000112</td><td>Kit de ensaio de proteínas; CUIDADO H314 Causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>D5628</td><td>CUIDADO H301 Tóxico se ingerido</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>D 0632</td><td>CUIDADO H318 Causa sérios danos aos olhos</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech, Alemanha</td><td>P04-05551</td><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>D2650</td><td>dimetilsulfóxido</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience, Suíça</td><td>LONBE17-512F</td><td>Dulbecco sem cálcio' s solução salina tamponada com fosfato</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>A5256701</td><td>soro fetal bovino</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich, EUA&</td><td>nbsp; G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Glicerofosfato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>Centrífuga</td><td>HM3S</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&nbsp;</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Alemanha</td><td>1701</td><td>centrífuga</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Honeywell Fluka, Áustria</td><td>56750</td><td>CUIDADO H302 Nocivo por ingestão, H314 Provoca queimaduras graves na pele e lesões oculares, H360D Pode danificar o nascituro</td></tr><tr><td></td><td>O projeto jamovi</td><td>Versão 2.3.13</td><td>software</td></tr><tr><td>K+-MES</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Leucosep&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Áustria</td><td>Z642843-300EA</td> tubo <td>de centrífuga com barreira de polietileno</td></tr><tr><td>Malato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>M1000</td><td>CUIDADO H319 Provoca irritação ocular grave.</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Scharlau, Espanha</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-Kit</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>60101-01</td><td>meio de respiração mitocondrial</td></tr><tr><td>Mixer&nbsp;</td><td>Swelab Instruments, Suécia</td><td>440S</td><td>mesa de balanço</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>5100-0001</td><td>recipiente de congelamento</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td></td><td>o NextGen-O2k e o O2k são abordados coletivamente com o termo ' Oroboros'</td></tr><tr><td>Câmara Oroboros cV</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>23100-01</td><td>câmara de volume clássico</td></tr><tr><td>Oroboros Chamber sV</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>33100-01</td><td>câmara de pequeno volume</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-Module</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>11100-03</td><td>Titration-Injection microPump</td></tr><tr><td>O2-Zero Powder</td><td>Oroboros Instruments, Áustria</td><td>26600-02</td><td>&nbsp; Na-ditionita CUIDADO H251 Autoaquecimento: pode pegar fogo, H302 Nocivo se ingerido, H319 Causa irritação ocular grave</td></tr><tr><td>octanoilcarnitina</td><td>Biotrend - APExBIO Technology, Alemanha</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>P2256</td><td>CUIDADO H317 Pode causar uma reação alérgica na pele</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>R8875</td><td>CUIDADO H300 Fatal se ingerido</td></tr><tr><td>Linhas celulares de fibroblastos da pele&nbsp;</td><td>&nbsp; ATCC, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>S2002</td><td>CUIDADO H300 + H310 + H330 Fatal se ingerido, em contato com a pele ou se inalado</td></tr><tr><td>Subtilisina A</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>P 5380</td><td>CUIDADO H318 - Causa sérios danos aos olhos, H334 - Pode causar sintomas de alergia ou asma ou dificuldades respiratórias se inalado</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células sanguíneas Swelab Alfa&nbsp;</td><td>Boule Diagnostics AB, Suécia</td><td>1420041</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>Tecan, Suíça</td><td></td><td>espectrofotômetro</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>T3134</td><td>N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenodiamina dicloridrato CUIDADO H315 Causa irritação na pele, H319 Causa irritação ocular grave</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>T4799</td><td>ATENÇÃO H334 Pode causar sintomas de alergia ou asma ou dificuldades respiratórias se inalado</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Áustria</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

Respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume

Investigating respiratory fluxes is decisive for understanding the complex interplay between metabolic processes. Studies of cells and tissues with ...

high-resolution-respirometry-in-a-small-volume-chamber

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Aqui, uma amostra de músculo quadríceps é retirada de um porco anestesiado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. Em seguida, as frequências respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial são determinadas por meio de respirometria de alta resolução.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Este protocolo apresenta a construção e utilização de um aparelho simplificado de pletismografia de corpo inteiro para monitorar a progressão da doença respiratória bacteriana de forma não invasiva.

Pletismografia simplificada de corpo inteiro para caracterizar a função pulmonar durante a melioidose respiratória

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

Este protocolo descreve a configuração e funcionamento de um sistema de micro-respirometria que pode ser empregado para investigar as características fisiológicas do holobionte coral.

Caracterização fisiológica do holobionte de coral utilizando uma nova ferramenta de microrrespirometria

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Aprenda respirometria de alta resolução em câmara de 0,5 mL para análise da função mitocondrial com menor volume amostral. Este método validado expande pesquisas em diagnóstico de doenças e desenvolvimento de fármacos.

Respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume

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