Name: Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Aprenda a preparar projéteis de gene gun revestidos com DNA e realizar transfecção biobalística em fatias de hipocampo de rato. Esta técnica permite visualizar neurônios individuais com eficiência em estudos de morfologia neural.

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Gostaríamos de agradecer a Mark Lucanic e Hwai-Jong Cheng para ajudar com a aquisição das imagens de baixa ampliação de fatias do hipocampo toda apresentadas neste vídeo. Gostaríamos também de agradecer a Sarah Parrish para ajudar com o texto que acompanha o vídeo.

PROTOCOLO PARA TRANSFECÇÃO biobalística Fazer balas Balas são boas para até 6 meses, mas pode começar a diminuir em termos de eficiência de transfecção após 2-3 meses. Balas devem ser armazenados a 4 ° C na presença de pellets dessecante. Sempre deixe os frascos de cintilação, em que as balas são armazenados, à temperatura ambiente antes de abrir o frasco. Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Espermidina (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100% de alta qualidade-garrafa fechada) </li><li> Autoclavado H 2 0 </li><li> DNA a ser transfectadas </li><li> Polivinilpirrolidona (PVP-20 ações mg / ml) </li><li> 2 X 15 ml cônico (2/bullet set) </li><li> Tubulação (cortado em 1 X ~ 30 polegadas conjunto bala /) </li><li> Cintilação frascos (set 1/bullet) </li><li> Pellets dessecação </li><li> Seringa de 10 ml w / tubo na extremidade </li></ul> Prepare tubulação: <ol><li> Dry ~ 30 polegadas de tubo (cerca de 2 polegadas, ultrapassam direito O-ring), na estação tubo w / N 2 de gás (0,4 de pressão) para um mínimo de 20 min. </li></ol> Precipitar DNA em contas de ouro: <ol><li> Prepare DNA a ser transfectados em 50 volumes μmL total em tubo de microcentrífuga (DNA máximo de 50 mg no total) </li><li> Pesar 6-8 mg de ouro e transferir para um tubo de microcentrífuga </li><li> Adicionar 100 mL de 0,05 M espermidina ao ouro e à sonicate por 20 segundos </li><li> Adicione o mL 50 de DNA ao ouro / espermidina </li><li> Vortex (cerca de configuração 5) w / tampa aberta </li><li> Add-drop 100 mL sábio de CaCl 2 1M </li><li> Sonicate brevemente (&lt;5 seg) </li><li> Permitir a precipitar por 10 min em temperatura ambiente </li><li> Sonicate brevemente </li></ol> Prepare a solução de PVP durante a sonicação: <ol><li> Faça solução diluída em 15 ml PVP cônica, 3,5 ml diluída PVP para cada conjunto de balas (adicionar 7,5 mL de 20mg/ml estoque PVP a 3,5 ml EtOH 100%) </li></ol> Lavagem contas de ouro com EtOH: <ol><li> Spin down contas de ouro a toda a velocidade por 10 segundos em microcentrífuga </li><li> Elimine o sobrenadante, mas manter uma pequena quantidade de líquido em cima de contas de ouro </li><li> Lavar 3X com 1ml EtOH, sonicate brevemente cada vez, se necessário </li></ol> Ressuspender ouro / DNA em solução PVP: <ol><li> Ressuspender o sedimento de ouro em 200 mL da solução diluída 3,5 ml PVP / EtOH </li><li> Vortex da pelota de ouro para voltar a suspender (brevemente sonicate se necessário) </li><li> Transferir os 200 mL de ouro / solução PVP para um novo 15 mL cônica </li><li> Continue desta maneira, adicionando 200 mL de PVP em um tempo até todo o ouro foi transferido para a 15 mL cônica, eo volume final é de 3,2 mL </li></ol> Tubo de revestimento: <ol><li> Desligue N 2 na estação tubo e remover tubos secos </li><li> Anexar tubos secos à seringa de 10 ml </li><li> Agitar vigorosamente o 15 mL cônica cheia de ouro / PVP </li><li> Coloque a extremidade do tubo em ouro / solução PVP e chupar lentamente tendo o cuidado de evitar bolhas </li><li> Deixar ~ 2 polegadas seca de ambas as extremidades do tubo </li><li> Com o tubo ainda ligado a seringa e preenchido com a solução de ouro / PVP, coloque cuidadosamente o tubo de volta na estação </li><li> Mark as extremidades do tubo onde a solução fica </li><li> Deixe o ouro se contentar com 5 min com a seringa conectada </li><li> Sugar-up a solução muito lentamente puxando a seringa de modo que o ouro resolvido é deixado para trás (não se esqueça de fazer lavagem de volta) </li><li> Separe a seringa </li><li> Rodar 90 ° e deixe descansar 2 segundo </li><li> Girar 180 ° e deixe descansar outro dois segundo </li><li> Rode o tubo por 5 segundos </li><li> Ligue o N 2, de modo que a válvula lê entre 0,4-0,5 e girar o tubo revestidas de ouro durante a secagem por 5 min. </li></ol> Corte de tubos: <ol><li> Remova a tubulação da estação prep-tubo e cortar as pontas na marca. </li><li> Colocar um frasco de cintilação rotulado sob o helicóptero para pegar tubos de cartuchos de corte </li><li> Tubulação lugar no helicóptero tubos e cortar o tubo com navalha limpa </li><li> Coloque um pellets dessecação em frasco de cintilação </li><li> Armazene os cartuchos a 4 ° C </li></ol> Tiroteio Slices Tissue Ao fotografar fatias cultivadas, é importante empregar uma técnica relativamente estéreis, a fim de evitar a contaminação. Lembre-se que ao fotografar duas construções diferentes, ambos os conjuntos de balas pode ser carregado no suporte do cartucho mesmo, mas o barril do forro e da tela deve ser alterado entre as construções. Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Balas DNA (vamos frasco de cintilação à temperatura ambiente antes de abrir) </li><li> Fatias de tecido </li><li> Helios Gene Gun </li><li> Hélio tanque com mangueira de arma gene ligado &lt;/ Li&gt; <li> Suporte do cartucho </li><li> Forro de plástico barril com O-ring no lugar </li><li> Difusor (modificado) </li><li> Tela difusor </li><li> Fórceps </li></ul> Preparar a arma gene: <ol><li> Forceps lugar usando o ouro cartuchos de plástico revestidas no suporte do cartucho. </li><li> Coloque o suporte do cartucho na arma gene pela primeira empurrando bloqueio </li><li> Segura o suporte do cartucho com bloqueio </li><li> Obter um forro barril com um anel de vedação ea tela difusor firmemente no lugar </li><li> Parafuso do cano-liner na arma gene </li></ol> Tiroteio fatias cultivadas com a arma gene: <ol><li> Coloque em aquecedores de orelha </li><li> Ligue a arma gene em mangueira de gás hélio tanque conectado </li><li> Aumente a pressão no tanque a 180 PSI </li><li> Atire um espaço em branco no ar, a fim de remover qualquer poeira ou restos da tela difusor. Para disparar a arma, primeiro aperte o botão de bloqueio de segurança até que a arma emite um sinal sonoro, em seguida, puxe o gatilho. </li><li> Depois de atirar no vazio, retire as fatias da incubadora </li><li> Arma avançar para construir primeiro </li><li> Atire com a tela difusor cerca de 0,5 - 1 polegada da fatia </li><li> Antecedência o cartucho entre os poços. </li><li> Depois de filmar o bem último, coloque as fatias de volta para a incubadora </li><li> Desligue a pressão do gás e liberação antes de separar a arma da mangueira Hélio </li><li> Desapertar forro do cano, e remova o cartucho e as conchas utilizadas </li></ol> Limpeza titulares cartucho e forros barril: <ol><li> Cartuchos lugar, forros barril, e telas de difusor em um copo com água e sabão </li><li> Coloque um copo no sonicador banho e sonicate por 20 min </li><li> Enxaguar com água até que todos os resíduos de sabão são removidos </li><li> Mergulhe em EtOH 70% por uma hora </li><li> Coloque sobre papel toalha para secar secar durante a noite </li><li> Limpar cartuchos, forros barril, e as telas podem ser reutilizados em subseqüentes transfections biobalística </li></ol> Problemas dicas de fotografia para Transfection biobalística Transfecção biobalística às vezes pode resultar em condições de transfecção de qualidade inferior. Ela pode levar a muito poucos ou muito muitas células transfectadas, muito alta ou níveis de expressão muito baixa, ou pode causar fatias de tecido para tornar-se geralmente pouco saudável. Muitas vezes resultam fatias insalubres da explosão de pressão. Aqui estão algumas dicas para obter fatias de tecido ideal transfectadas. Se fatias parecem ser pouco saudável (ou se as células demais estão transfectadas / fatia), tente: <ul><li> distância de disparo aumentar </li><li> diminuição da pressão sobre tanque de gás </li><li> diminuindo a quantidade de ouro </li><li> cortando o centro do difusor Bio-Rad e substituindo o centro com uma tela difusor. </li></ul> Se as células transfectadas são muito poucos, tente: <ul><li> diminuindo distância de disparo </li><li> pressão crescente sobre tanque de gás </li><li> aumentar a quantidade de ouro </li><li> aumentar o número de fatias de tecido / poço </li><li> certifique-se o O-ring no barril-liner está intacta. </li></ul> Se você obter fatias com ambas as células demais e demasiado poucos transfectadas durante as filmagens mesmo certifique-se: <ul><li> que você está segurando a arma simetricamente acima bem </li><li> que o ouro é uniformemente revestimento interior da tubulação. (Se você está recebendo uma linha de ouro, extrair o sobrenadante do tubo a uma taxa mais rápida uma vez que o ouro tem estabelecido e girar o ouro mais antes de ligar o nitrogênio. Se, por outro lado, você está recebendo listras de ouro , este é provavelmente devido à exposição demasiada umidade durante a tomada de bala: certifique-se que você está usando uma garrafa fechada de EtOH, que a tubulação está completamente seco antes do revestimento, e que você nivelamento das tampas e preparar balas em tempo hábil). </li></ul> Se a eficiência de transfecção parece ótimo (# células transfectadas / fatia), mas o nível de expressão parece muito alta ou muito baixa: <ul><li> ajustar o DNA relação ao ouro. (Por exemplo, se for demasiado baixa manter a quantidade de ouro, mas aumentar a quantidade de DNA.) </li><li> ajustar a quantidade de tempo entre fotografia e coleta de dados </li></ul> No caso de transfecção dual, se você está recebendo muito pouca expressão de um de seus construtos, ajustar a relação dos dois construtos de maneira apropriada e certifique-se que ambas as construções estão sob o mesmo promotor, para se certificar de que um promotor não vai competir fora do outro.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Transfecção biobalística é um meio físico de transfecting células via bombardeamento de tecido vivo com alta velocidade de DNA revestido partículas de ouro. Em partículas transferência de genes mediada, em geral células transfectadas resultado quando a bala vem para descansar no núcleo. Embora muitos métodos de transfecção diferentes existem, como microinjeção, lipofílico de fosfato de cálcio-transfecção eletroporação, transfecção e viral, transfecção biobalística pode oferecer um trabalho menos intensivo, e alternativa eficiente para transfecting células que não são facilmente transfectadas com estes outros métodos. Na verdade, ele foi desenvolvido inicialmente como uma técnica para transferência de genes em plantas, pois a presença da parede celular feita através de métodos de transfecção difícil preexistentes 1. Da mesma forma, Biolistics ganhou popularidade no campo da neurobiologia já pós-mitóticas neurônios são notoriamente difíceis de transfecção 2,3. Em particular, é amplamente reconhecido como a técnica de princípio para ser usado em experimentos que visam avaliar a morfologia multa de neurônios individuais em fatias de cérebro intacto. Os métodos descritos aqui apresentar uma explicação detalhada e abrangente de como executar transfecção biobalística de fatias de cérebro de cultura usando um gene de mão-gun (o Helios sistema Gene Gun; Bio-Rad). Transfecção biobalística tem se tornado o método preferido para transfecting neurônios em cultura fatia, pois permite que a transfecção de um número escasso de células em todo o fatia do cérebro. Desta forma, os neurônios individuais podem ser examinados de forma isolada. Uma vez que esta técnica é particularmente adequada para transfecting neurônios no cérebro fatia, é muitas vezes usado em conjunto com dois fótons de microscopia, uma vez que a visualização 2-fóton de excitação das células permite fluorescente etiquetado profunda no tecido de espalhamento de luz 4. Na verdade as imagens de alta ampliação único neurônios piramidais apresentados ao longo deste video foram capturados usando um microscópio a laser personalizado construído dois fótons de digitalização. Em conclusão transfecção biobalística é um meio eficiente de transfecting células individuais dentro do contexto de uma alta densidade de células vizinhas, e como tal tem se mostrado extremamente útil para fluorescente rotulagem neurônios individuais na cultura fatia neuronal.

Embora tenhamos listados todos os produtos separadamente, é mais econômico para compra &quot;Helios Gene Gun-System&quot;, que inclui com todos os produtos da Bio-Rad listados acima (cat # 165-2431).

preparação de gene gun bullets e transfection biobalística de neurônios em cultura slice

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Transfecção biobalística é um meio físico de transfecting células bombardeando tecido com partículas de alta velocidade DNA revestido. Nós fornecemos um protocolo detalhado para transfecção biobalística de rato fatias do hipocampo, desde a preparação inicial de balas revestidas de DNA para o tiroteio final das culturas fatia organotípicas usando uma arma gene. Transfecção arma gene é um meio eficiente e fácil de transfecting neurônios e é especialmente útil para fluorescente rotulagem um pequeno subconjunto de células na fatia do tecido. Neste vídeo, primeiro esboço dos passos necessários para revestir as partículas de ouro com DNA. A seguir, demonstram como a linha de dentro do tubo de plástico com as balas de ouro / DNA, e como cortar essa tubulação para obter os cartuchos de plástico para carregar na arma gene. Finalmente, realizamos biobalística transfecção de culturas hipocampais de ratos fatia, demonstrando manipulação da Bio-Rad Helios arma gene, e oferecendo conselhos de resolução de problemas para obter fatias de tecido saudável e ideal transfectadas.

Nós descrevemos um método para preparar balas DNA revestido de ouro e demonstrar o uso de balas tais biolistically transfectar neurônios em cultura de fatias do hipocampo.

Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

A transfecção biolística é um meio físico de transfectar células através do bombardeamento de tecidos com partículas revestidas de DNA em alta velocidade. Fornecemos um...

A transfeção biótica ou por partículas (gene gun) é um método físico de transfectar células, que consiste em bombardear o tecido com partículas revestidas de DNA em alta velocidade. Esta técnica é um meio eficiente e simples de transfectar neurônios, sendo especialmente útil para transfectar apenas um pequeno número de células em cortes de tecido. Por exemplo, em microscopia fluorescente, estudos destinados a examinar a morfologia neuronal em um corte intacto.A transfeção com Bic facilita a visualização de neurônios individuais em um fundo limpo de células não transfectadas. Neste vídeo, demonstramos um método para produzir balas de canhão genético revestidas com DNA e, em seguida, realizar a transfeção com Bic em culturas de fatias hipocampais organotípicas. Olá, sou Georgia Woods.Sou estudante de pós-graduação no laboratório da Dra. Karen Zito na Universidade da Califórnia em Davis. Hoje demonstrarei como produzir projéteis revestidos com DNA e como realizar a transfeção Bic em fatias hipocampais de rato. As etapas básicas da transfeção Bic consistem em: primeiro, revestir partículas de ouro com o DNA a ser transfectado; segundo, revestir o interior do tubo plástico com esse ouro; terceiro.Corte o tubo em cartuchos para carregar na pistola de genes e, em seguida, bombardeie o tecido a ser transcrito. Então, vamos começar. Antes de estarmos prontos para a transfeção, precisamos primeiro preparar as microesferas revestidas com DNA.Isso envolverá o revestimento de partículas de ouro de 1,6 mícron com o plasmídeo de DNA a ser transfectado. Durante o disparo, uma partícula individual de ouro atuará como o projétil que penetrará na célula, levando à transfeção. Portanto, primeiro precisamos preparar o DNA a ser transfectado.Idealmente, você deve usar menos de 50 microgramas de DNA por conjunto de projéteis, em um volume total de 50 microlitros de água. Tenha em mente que a quantidade exata de DNA a ser utilizada deve ser determinada empiricamente para cada construto, com base na obtenção do nível ótimo de expressão. Agora que temos nossa alíquota de DNA, precisamos adicionar espermidina às microesferas de ouro.Adicione aos oito mg de ouro previamente pesados, cem microlitros de esperma, meine e sonique por aproximadamente 20 segundos. É esperma.Meine é uma poliamina que carrega positivamente as nanopartículas de ouro, levando ao interação com o DNA carregado negativamente por meio do metal carregado positivamente. Após o 22º filho, adicione a solução aquosa de DNA de 50 microlitros ao ouro. Assim que o DNA for adicionado às esferas, agite em vórtex enquanto adiciona, gota a gota, cem microlitros de cloreto de cálcio. O cloreto de cálcio faz com que o DNA precipite.Após uma breve agitação em vórtex, deixe a solução precipitar por 10 minutos. Após a precipitação de 10 minutos, centrifugue o DNA e o ouro em velocidade máxima por 30 segundos em uma centrífuga de bancada; após a 32ª centrifugação em alta velocidade, remova a maior parte do sobrenadante com pipeta, mas evite aspirar o pellet de ouro. Neste momento, estou apenas removendo qualquer DNA que não tenha precipitado sobre o ouro.As partículas de ouro são então lavadas em um mililitro de etanol completamente novo e sonicadas brevemente. Uma vez que o DNA precipita, ele tende a causar a agregação do ouro. Uma leve sonicação desfaz esses agregados de ouro. Porém, tenha cuidado para não quebrar o DNA por sonicação excessiva.Os pellets de ouro são centrifugados novamente e o etanol é removido por pipetagem. Repita a lavagem com etanol mais duas vezes. Após a terceira lavagem com etanol, adicione 200 microlitros da solução diluída de polivinil pirrolidona ou PVP e sonique.Transfira rapidamente o ouro revestido para um cônico de 15 mil já contendo 200 microlitros de solução diluída de PVP. O PVP é um solvente que fará com que as partículas de ouro adiram ao tubo plástico utilizado. Na próxima etapa, remova traços de microesferas de ouro remanescentes no tubo epi adicionando 200 microlitros de PVP ao tubo epi.Em seguida, agite brevemente e transfira para o tubo cônico de 15 mL. Repita isso até que todo o ouro tenha sido transferido para o tubo cônico de 15 mL. Transfira a solução restante de PVP para que o ouro fique agora ressuspenso em uma solução de 3,2 mL de PVP em etanol.Agora estamos prontos para revestir o tubo plástico que será usado para acomodar as microesferas do canhão de genes quando forem carregadas no dispositivo. Agora que o ouro está revestido com DNA, precisamos forrar o interior do tubo plástico com as partículas de ouro. Esse tubo plástico revestido com ouro é o que realmente será carregado no compartimento do canhão de genes.Inicie cortando um pedaço de tubo de modo que ele se estenda cerca de cinco centímetros além do anel O. Uma vez que o tubo tenha sido colocado na estação de preparo de tubos, gire a válvula de pressão para que o medidor de fluxo indique aproximadamente 0,4. O nitrogênio fornece uma atmosfera livre de água para secar o tubo; seque o tubo por cerca de 20 minutos.É melhor realizar esta etapa de secagem enquanto você estiver revestindo as microesferas de ouro com DNA, conforme mostrado na etapa anterior. Dessa forma, o tubo estará seco e pronto para ser revestido assim que você terminar. Preparar as microesferas de ouro agora que o tubo está seco e que o ouro foi revestido com o DNA.Desligue a estação N two antes de encher a tubulação com a sua solução de PVP-ouro e remova a tubulação seca da estação, anexando-a à seringa de 10 mil antes de aspirar o PVP e o ouro para dentro da tubulação. Agite bem a solução e imediatamente aspire-a para dentro da tubulação seca, evitando bolhas. Além disso, tenha cuidado para não aspirar a solução para dentro da seringa.Com o tubo agora preenchido com a solução de PVP Gold, coloque cuidadosamente o tubo de volta na estação N dois. Deixe a solução repousar por cinco minutos com a seringa acoplada, para que as partículas de ouro sedimentem no fundo do tubo. Marque as extremidades do tubo onde a solução se acomoda.Após a solução assentar, uma faixa de ouro será visível na parte inferior do tubo usando a seringa acoplada. Remova o sobrenadante muito lentamente, certificando-se de não provocar uma lavagem reversa nem desconectar o tubo. Agora precisamos rotacionar e secar o tubo para aderir o ouro uniformemente por toda a superfície interna do tubo.Primeiro, gire o tubo em 90 graus. Aguarde dois segundos. Agora, gire mais 180 graus e aguarde outros dois segundos.Gire por cinco segundos e, finalmente, ligue o N dois para que o mostrador indique entre 0,4 e 0,5 e continue girando enquanto a tubulação seca por cinco minutos. Agora que se passaram cinco minutos e nosso ouro está seco, precisamos cortar a tubulação em cartuchos que possam ser carregados na pistola de genes. Agora vou cortar a tubulação em seções de aproximadamente meio centímetro para fabricar as cápsulas, que terão o tamanho apropriado para serem inseridas no cilindro da pistola de genes.Para coletar as conchas, posicione a bile de simulação de selo sob o cortador, corte o tubo nas marcações e corte o tubo com uma lâmina limpa. Coloque o tubo no cortador de tubos para obter um comprimento adequado. Basta alimentar o tubo para a frente até sentir resistência e, em seguida, cortar.Após o corte e coleta do tubo no frasco de cintilação, coloque um comprimido de dessicante no frasco de cintilação. Os projéteis são eficazes por até seis meses, mas após dois a três meses podem começar a apresentar uma diminuição na eficiência de transfeção. Portanto, é uma boa prática rotular o frasco com o nome da construção e a data.As microbalas podem ser usadas imediatamente após sua preparação ou armazenadas a quatro graus Celsius. Se você estiver utilizando microbalas armazenadas a quatro graus Celsius, deixe o frasco da estação aquecer à temperatura ambiente por cerca de 15 minutos antes de abri-lo, a fim de evitar que as microbalas absorvam umidade. Agora estamos prontos para disparar as microbalas de DNA usando uma pistola de genes.Agora que os projéteis estão prontos, estou pronto para realizar a transfeção balística nas células. Usarei um canhão de genes BioRad Helios e atirarei em fatias de hipocampo de rato que foram incubadas por cinco dias desde o dissecamento. O canhão de genes será conectado a um tanque de gás hélio.Quando a arma é disparada, uma breve rajada de pressão do tanque acelerará as partículas de ouro em direção à fatia. De modo geral, quando uma partícula de ouro termina incorporada no núcleo da célula, essa célula será transfectada.Como estou realizando transecções em fatias cultivadas, emprego uma técnica relativamente estéril durante toda a transfeção com Bic para evitar contaminação. Assim que os cartuchos atingirem a temperatura ambiente, abra o frasco de simulação e coloque os cartuchos de plástico revestidos com ouro no suporte de cartuchos. Em seguida, coloque o suporte de cartuchos na pistola de genes empurrando primeiro a trava do cilindro para trás.Agora, o revestimento do cilindro precisa ser fixado à arma. Primeiro, certifique-se de que a junta toricada esteja no revestimento do cilindro e de que a tela difusora esteja bem fixada. A tela atua distribuindo a pressão proveniente do cilindro e conduz ao espalhamento do ouro, promovendo uma dispersão mais uniforme do ouro no poço.Parafuse o revestimento do cano completamente na pistola de genes. Ao disparar dois construtos diferentes, ambos os conjuntos de projéteis podem ser carregados no mesmo porta-cartucho, mas o revestimento do cano e a tela devem ser trocados entre os construtos. A pistola de genes está agora pronta para ser conectada à fonte de hélio.Conecte a pistola de genes à mangueira ligada ao tanque de gás hélio. Ela deve encaixar-se firmemente; em seguida, aumente a pressão do tanque para 180 PSI. A pistola está agora pronta para disparar, mas antes disso, lembre-se de usar proteção auricular e, para remover qualquer poeira ou detrito da tela difusora, dispare um cartucho vazio para limpar a pistola.Primeiro, pressione o botão do intertravamento de segurança até a arma emitir um sinal sonoro e puxe o gatilho. Agora estamos prontos para disparar a fatia. Após o disparo do branco, remova as fatias do incubador.Durante nossas dissecações do hipocampo, colocamos quatro fatias por poço e as organizamos de modo a formar os cantos de um quadrado de dois centímetros próximo ao centro da membrana. Ilumine cada poço com a tela difusora a cerca de meio a um polegada de distância da fatia. As células transfectadas geralmente podem ser examinadas entre um e cinco dias, dependendo do construto.Após todos os poços terem sido bombardeados, desligue o gás e libere a pressão antes de desconectar a pistola da mangueira de hélio. Remova os cartuchos e as cápsulas usadas. Desparafuse o revestimento do cano; os cartuchos, revestimentos do cano e as telas podem ser limpos colocando-os em um banho de água com sabão e submetendo-os à sonicagem por 20 minutos, enxaguando completamente em água, mergulhando em etanol 70% por uma hora e, em seguida, colocando-os sobre uma toalha de papel seca durante a noite.Cartuchos e telas limpos podem então ser reutilizados em transfeções bióticas subsequentes. Agora, vamos analisar alguns dos resultados de transfeção. Mesmo para um preparo padrão de fatias hipocampais, pode haver uma variação considerável nas eficiências de transfeção, dependendo das microesferas e das fatias.De modo geral, uma eficiência de transfeção relativamente baixa é desejável para se obter neurônios transfectados bem isolados. Além disso, quando um número excessivo de células é transfectado, a saúde geral do fragmento é comprometida, mesmo sob condições ideais. Normalmente, há menos de 20 células por fragmento, mas frequentemente outros fragmentos no mesmo poço acabam por apresentar um número muito maior de células.Os cortes transfectados e os demais apresentarão menor número de células. As inconsistências na eficiência de transfeção entre cortes geralmente ocorrem porque a posição dos cortes em relação ao cano não era simétrica, ou porque o ouro não foi uniformemente depositado ao redor do tubo, estando concentrado em um único lado. Se um número excessivo de células for transfectado, tente aumentar a distância de disparo em relação à amostra, diminuir a pressão de disparo ou reduzir a quantidade de ouro utilizada na confecção dos projéteis.Aqui você pode observar um excelente exemplo de um neurônio parametal transfetado. Nessa célula específica, podemos ver uma cápsula de ouro inserida na célula. Veja uma visão ampliada de um neurônio transfetado. Em ca um, às vezes a eletroporação pode levar a fatias não saudáveis.Frequentemente, fatias não saudáveis resultam do jato de pressão. O sistema de canhão de genes Helios é fornecido com um difusor que possui uma cruz metálica em seu centro. Removemos a cruz metálica interna e, em vez disso, utilizamos uma tela metálica no lugar dessa cruz.Cortamos simplesmente a tela um pouco maior que a extremidade do revestimento do cano e a prendemos entre a extremidade do revestimento do cano e o difusor cortado. Descobrimos que isso melhora a saúde dos cortes. Além disso, as condições ideais de disparo variarão conforme a preparação experimental, de modo a otimizar diferentes preparações experimentais, variando a pressão no tanque de hélio e a distância de disparo em relação à amostra.Por fim, caso deseje utilizar partículas com dois construtos diferentes para transfeção dupla, certifique-se de que ambos os construtos estejam sob o mesmo promotor. Dessa forma, um promotor não irá superar o outro. Acabei de mostrar como preparar partículas para canhão de genes e como transfectar fatias hipocampais utilizando a transfeção BIC.Este é um método extremamente poderoso para realizar estudos morfológicos em neurônios individuais que podem ser imagiados isoladamente. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem...

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Fonte: Keener, D. G., et al. Eletroporação de célula única em diferentes culturas de fatias organotípicas de neurônios excitatórios do hipocampo de camundongos e inibitórios específicos de classe. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o processo de eletroporação de célula única para introduzir DNA de plasmídeo em neurônios dentro de culturas de fatias de hipocampo de camundongos. O procedimento envolve posicionamento preciso da pipeta, ajustes de pressão e pulsos de eletroporação para...

Expressão gênica via eletroporação de célula única em culturas de fatias de hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o protocolo para eletroporação de genes de célula única em neurônios excitatórios e inibitórios em uma variedade de culturas de fatias de hipocampo in vitro. A técnica é útil para examinar funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações de proteínas transsinápticas.

Eletroporação de célula única em culturas organotípicas de fatias cerebrais: uma técnica in vitro para entregar plasmídeos dentro de neurônios-alvo em fatias cerebrais do hipocampo

Fonte: Denaxa, M., el al., Transplante de progenitores de interneurônios corticais quimiogeneticamente modificados em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para injetar um vetor de plasmídeo carregando o gene de interesse em progenitores interneurônios em uma fatia de cérebro embrionário, seguido de eletroporação para entrada de plasmídeo e expressão gênica. Esses progenitores modificados podem ser usados posteriormente para o...

Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

Melhorias recentes nas preparações organotípicas de fatias de cérebro permitiram sua exploração para aplicações biotecnológicas. As fatias organotípicas mantêm características estruturais locais da biologia in vivo, incluindo conexões sinápticas funcionais. Aqui apresentamos um método de entrega biolística regiosseletiva para rotular e manipular geneticamente essas fatias.

Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Aprenda a preparar projéteis de gene gun revestidos com DNA e realizar transfecção biobalística em fatias de hipocampo de rato. Esta técnica permite visualizar neurônios individuais com eficiência em estudos de morfologia neural.

Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

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