Triagem in vitro baseada em LED para avaliação de moléculas fotoativáveis na inativação fotodinâmica bacteriana

Minha pesquisa está focada na exploração de diferentes moléculas da família de compostos flavílicos, naturais e sintéticos, com um interesse central em estudar sua bioatividade no contexto da fotoproteção UV e avaliar seu potencial como fotossensibilizadores para aplicações de terapia fotodinâmica. As descobertas recentes em nosso grupo de pesquisa demonstraram as propriedades ativadas pela luz dos corantes flavílio à base de aminoácidos, estabelecendo-os como uma nova classe promissora de fotossensibilizadores. Esses compostos exibem um potencial significativo para exploração adicional, abrindo caminho para aplicações inovadoras no campo.

Usando o sistema de microplacas e painéis de luz de 96 poços, podemos obter uma triagem de alto rendimento de fotossensibilizadores em um ambiente controlado, simplificando a identificação e comparação entre diferentes candidatos à terapia fotodinâmica. Para começar, introduza a bactéria Staphylococcus aureus na placa de ágar Mueller-Hinton da cultura de parada. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 24 horas para obter uma cultura fresca.

Colete duas a três colônias frescas da placa de ágar e dilua-as em seis mililitros de PBS filtrado estéril pré-aquecido a pH 7,4. Vortex o inóculo a 1.200 rotações por minuto por três a quatro ciclos para homogeneizar a amostra e retirar três mililitros do inóculo homogeneizado para uma cubeta descartável. Depois de medir a densidade óptica em 600 nanômetros, dilua a amostra para corresponder à densidade óptica de 0,1 usando PBS.

Preparar uma solução-mãe do composto fotossensibilizador num solvente adequado, tal como DMSO ou PBS. Dilua a solução de estoque em PBS para criar a solução de trabalho, garantindo que os componentes do meio de cultura bacteriano não interfiram na absorção da luz. Vortex a solução de trabalho para garantir a homogeneização completa.

Para começar, prepare a suspensão de Staphylococcus aureus e a solução de trabalho do composto fotossensibilizador. Prepare duas placas separadas de 96 poços, uma designada para exposição à luz e outra para controle escuro. Em cada placa, dispense 100 microlitros de cada uma das soluções fotossensibilizadoras e da suspensão bacteriana.

Misture as soluções 5 a 10 vezes com a pipeta. Incube as placas a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir que o fotossensibilizador interaja com as células bacterianas. Após a incubação, remova as placas da incubadora.

Mantenha uma das placas protegida da exposição à luz como controle escuro. Coloque a outra placa de 96 poços acima do painel de LED retangular de 50 watts. Marque as bordas da placa na superfície do LED para garantir um posicionamento consistente nas repetições do protocolo.

Exponha a placa à luz LED por cerca de 15 minutos. Use outra placa de 96 poços para preparar diluições seriadas das amostras, incluindo controles, poços não irradiados e irradiados. Adicione 180 microlitros de PBS a cada poço, de acordo com o número de amostras.

Alíquota de 20 microlitros de cada poço nas placas irradiadas e não irradiadas na primeira coluna da placa preenchida com PBS. Usando uma micropipeta multicanal, execute uma diluição serial simples do poço 1 ao 6. Dividir uma placa de ágar-ágar em seis secções iguais, correspondendo cada secção a uma das diluições.

Alíquota de 10 microlitros de cada poço na seção correspondente da placa de ágar. Incube a placa por 18 a 20 horas. Remova a placa de ágar da incubadora e identifique as áreas adequadas para a contagem de colônias.

Dentro de cada seção da placa helicoidal, conte o número de unidades formadoras de colônias. O espectro de alcance da luz visível mostrou três picos distintos entre 400 e 700 nanômetros. Em condições escuras, nenhum dos compostos flavílicos testados apresentou efeitos citotóxicos.

Em contraste, após a exposição à luz, os compostos testados causaram uma diminuição dependente da dose na viabilidade de Staphylococcus aureus com efeitos significativos observados em concentrações de 6 e 12 micromolares.