Detecção de Autoanticorpos Anti-MDA5 Utilizando Células HeLa e Imunocitoquímica com Microscopia de Luz

O principal objetivo do experimento a seguir é usar imunocitoquímica para rastrear anticorpos anti-MDA5. Isso é feito usando as células HeLa e, em seguida, transfectar a célula HeLa com a construção MDA5. Como tal, as células HeLa produzirão proteínas MDA5 que podem ser ligadas por anticorpos MDA5.

Depois de incluir a célula HeLa com a construção MDA5, o reagente Triton é usado para permeabilizar a membrana das células HeLa, o que permitiria a passagem dos anticorpos anti-MDA5. Depois disso, o soro do paciente que contém os anticorpos anti-MDA5 é adicionado. Os anticorpos anti-MDA5 então se ligariam às proteínas MDA5 dentro das células HeLa.

Depois disso, os anticorpos secundários, aos quais a peroxidase de rábano está ligada, são implantados nas células, os anticorpos secundários se ligam aos anticorpos anti-MDA5. Finalmente, o cromógeno é adicionado às células e oxidado na presença de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, produzindo uma cor visível sob um microscópio óptico. Um resultado positivo em pé mostraria algo como a imagem acima.

Na demonstração em vídeo de hoje, entramos em uma área crítica da pesquisa médica, a detecção do anticorpo cinco do gene cinco associado à diferenciação do melanoma, também chamado de anticorpo anti-MDA5. Esses autoanticorpos desempenham um papel crítico de indicador diagnóstico simples para pacientes com doença pulmonar intersticial, especialmente aqueles com doença pulmonar intersticial rapidamente progressiva. A detecção precoce e precisa do autoanticorpo MDA5 é vital para o gerenciamento eficaz dessa doença autoimune grave.

A principal vantagem do método que demonstramos sobre o método dourado de triagem de autoanticorpos anti-MDA5 é que ele pode ser feito mais rapidamente e economizar tempo e esforço em comparação com o ensaio tradicional de imunovisitação radiomarcada. Essa maior eficiência nos permite processar mais amostras e gerar resultados rapidamente. Além disso, é crucial observar que nosso método não apenas oferece eficiência superior, mas também em segurança e custo-benefício quando comparado ao ensaio de imunoprecipitação de transição.

Agora, vamos ver como isso é feito. Meu assistente de pesquisa, Teo Kai Fa, liderará o procedimento. Mantenha as células HeLa com o meio de Eagle modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico antimicótico a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.

Passe as células a cada dois ou três dias, ou quando as células atingirem 90 a 100% de confluência. Coloque 70.000 células HeLa em cada poço de uma placa de 24 poços. 24 horas antes da transfecção, e líquido das células, que aproximadamente 90% de confluência.

Dilua 500 nanogramas de plasmina e 1,5 microlitro de reagente de transfecção cada um em 25 microlitros de meio de soro reduzido. Adicione DNA diluído, faça reagente de transfecção diluído na proporção de um para um. Misture bem e incube por cinco minutos.

Adicione a mistura às células assentadas um dia antes e agite para misturar o complexo lipídico do DNA imediatamente. Confirme se as células são 80 a 90% confluentes. Incube as células a 37 graus Celsius em um hemisfério umidificado de 5% de CO2, 40 a quatro horas, e prossiga para a imunocitoquímica.

Usamos um fator disponível comercialmente. Mais informações podem ser encontradas na tabela de materiais. Sua eficácia de transfecção é de 50% O sucesso da transfecção e a expressão da proteína alvo podem ser determinados transfectando as células com a proteína congelada que expressa o plasmídeo e conduzindo o sangue ocidental para visualizar a expressão da proteína alvo Após a incubação, lave as células duas vezes com PBS para remover qualquer meio restante.

A lavagem pode ser realizada agitando a placa ou um agitador orbital. Fixe as células com 4% de paraformaldeído em PBS Cuidado. O paraformaldeído é tóxico.

Use diretrizes de manuseio apropriadas. Deixe as células por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, descarte o reagente fixador.

Use PBS para lavar a célula duas vezes. Aplique o reagente Triton e deixe as células descansarem por 10 minutos em temperatura ambiente. Usamos Triton X 400 em PBS na concentração de 0,3%Após 10 minutos, descarte o reagente Triton.

Adicione PBS para lavar as células uma vez. Próximo passo, execute o bloqueio com 10% de soro bovino fetal em PBS e deixe as células por uma hora em temperatura ambiente, remova o reagente de bloqueio. Em seguida, adicione PBS para lavar as células uma vez.

Adicione o plasma diluído do paciente às células. Certifique-se de diluir o plasma do paciente em uma proporção de uma para 5.000 diluições em PBS antes de usar. Ajuste a diluição para melhorar o sinal ou reduzir o fundo conforme necessário para garantir resultados imparciais.

A equipe realizou o teste, não tinha conhecimento de quais amostras pertenciam a pacientes e quais eram de indivíduos saudáveis. Incubar uma amostra a quatro graus Celsius por 12 a 16 horas. Após o período de incubação, remova a amostra do paciente e lave as células três vezes com PBS.

Trate as células com cabra conjugada com peroxidase de rábano diluída, IgG anti-humana em uma proporção de uma diluição de 250 em PBS. Deixe as células por uma hora em temperatura ambiente. Uma hora depois, descarte o anticorpo secundário.

Enxágüe com PBS três vezes. Depois de lavar as células, core-as com uma solução de trabalho DAB de 300 microlitros por poço. A solução de trabalho DAB é preparada faltando o concentrado promocional DAB e o diluente DAB seguindo as instruções do fabricante.

Depois de manchar a célula por cinco minutos, remova o corante. Após retirar o corante, enxágue com água destilada ionizada e agite por cinco minutos. Contra-core o núcleo da célula com hematoxina diluída.

Usamos hemotoxina em como um, em 10 dobras de diluição. Aguarde cinco minutos para o processo de coloração. Após cinco minutos, descarte a hemotoxina e lave com a água destilada analisada duas vezes por cinco minutos cada.

Etapa final, observe os resultados da coloração em um microscópio óptico. Vamos interpretar os resultados do nosso ensaio de imunocitoquímica para autoanticorpos anti-MDA5. Um resultado positivo.

Um verdadeiro positivo mostra uma forte coloração marrom dentro de HeLa expressando MDA5. Isso confirma os autoanticorpos anti-MDA5 na amostra do paciente. Um resultado negativo.

Um resultado negativo mostra células HeLa sem coloração marrom, indicando que não há autoanticorpos anti-MDA5. Um resultado falso positivo. Criticamente, um falso positivo mostra extensa coloração marrom em todas as células, independentemente da expressão de MDA5s.

Essa coloração inespecífica observada para condições autoimunes deve ser diferenciada de um verdadeiro positivo para evitar diagnósticos incorretos. Nosso método oferece uma maneira mais rápida, segura e econômica de detectar anticorpos anti-MDA5 para órgãos. Isso tem o potencial de impactar significativamente os resultados dos pacientes no tratamento da doença pulmonar intersticial.

Depois de assistir a este vídeo, você terá aprendido como realizar o procedimento de imunocitoquímica e como identificar clinicamente relevantes nos resultados do teste.