Name: Dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de dissociação enzimática e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama em camundongos. Este método de alto rendimento permite estudar respostas sistêmicas a tumores humanos de forma eficiente.

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<meta charset="utf8"></head><body>Dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renewable+tissue+resource+of+phenotypically+stable%2C+biologically+and+ethnically+diverse%2C+patient-derived+human+breast+cancer+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models.</a> Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).</li>
<li>Wilson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+xenograft+model+implicates+peroxisome+proliferator-activated+receptor+signaling+as+driver+of+cancer-induced+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue.</a> Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).</li>
<li>Wilson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+reprogramming+by+breast+cancer+regardless+of+treatment+history+or+tumor+molecular+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype.</a> NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+Protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).</li>
<li>Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+breast+cancer+and+their+predictive+power%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power.</a> Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).</li>
<li>Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+human+breast+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local regulation of human breast xenograft models.</a> J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).</li>
<li>Okano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+achieves+better+engraftment+and+faster+growth+than+subcutaneous+implantation+in+breast+cancer+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).</li>
<li>Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+antibiotics+in+cell+culture+with+caution%3A+Genome-wide+identification+of+antibiotic-induced+changes+in+gene+expression+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation.</a> Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).</li>
<li>Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+system+effects+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Immune system effects on breast cancer.</a> Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL de seringa de tuberculina</td><td>BD</td><td>305945</td><td>estéril</td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>estéril</td></tr><tr><td>2,0 mL tubo de microcentrífuga de fundo redondo</td><td>Eppendorf</td><td>0030123620</td><td>agulha estéril</td></tr><tr><td>de 26 G, &frac12; pol.</td><td>BD</td><td>305111</td><td>microtubo estéril</td></tr><tr>de<td>5,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030119401</td><td>estéril</td></tr><tr><td>NSG de 8+ semanas (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) The</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>extrato estéril</td></tr><tr><td>de membrana basal (Matrigel)</td><td>Cultrex</td><td>3632-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão, 6 pol.</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-553</td><td></td></tr><tr><td>fórceps curvo estéril com pontas médias não serrilhadas, 152 mm</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>50-365-845</td><td></td></tr><tr><td>creme depilatório</td> estéril <td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo dissociador com aquecedores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi nº 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-162</td><td>esponjas de</td></tr><tr><td>gaze não tecidas estéreis, 4x4 polegadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-558</td><td>estéril</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x + L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>estéril</td></tr><tr><td>Kit de dissociação de tumor, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr></tbody></table>

dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama

High-Throughput Dissociation and Orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-Derived Xenografts

Este estudo descreve uma abordagem eficiente e não cirúrgica para o implante ortotópico de xenoenxertos de câncer de mama derivados de pacientes em camundongos. O tecido tumoral da mama foi dissociado usando enzimas humanas específicas e agitação mecânica, ressuspenso em uma proporção de 1:1 v/v de Matrigel: RPMI 1640 e injetado ortotopicamente nas bolsas de gordura mamárias inguinais de camundongos NSG (Figura 1 e Figura 2). Para garantir a fidelidade dos modelos PDX, a concordância da amostra original do tumor do paciente com os tumores passados foi validada com técnicas histopatológicas e genômicas estabelecidas. A expressão do receptor foi perfilada usando coloração imuno-histoquímica (IHC) de receptores padrão de câncer de mama, incluindo receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) e receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) (Figura 3). A morfologia celular foi avaliada usando coloração de hematoxilina e eosina (H&amp;E) de cortes tumorais seccionados e interpretação patologista especialista dos cortes corados. A preservação da paisagem genética e a retenção de células humanas foram validadas usando sequenciamento de RNA em massa e autenticação de repetição curta em tandem (STR) (Figura 4 e Tabela 1). Além disso, o teste de patógenos não identificou contaminação do paciente ou amostras de tumor passadas, o que é uma etapa de verificação essencial devido ao uso de camundongos imunodeficientes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig1.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do protocolo. Representação do fluxo de trabalho de dissociação e injeção de tumores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os camundongos NSG foram preparados para injeção usando um creme depilatório aplicado em movimentos alternados no sentido horário e anti-horário para remover completamente o pelo da área da almofada de gordura mamária inguinal (Figura 2A). O excesso de creme depilatório foi limpo da pele abdominal exposta com gaze estéril e a área foi desinfetada com compressa com álcool (Figura 2B). Uma agulha estéril carregada com células tumorais dissociadas foi posicionada em um ângulo de aproximadamente 45 graus 0,5-1 mm caudal às bolsas de gordura mamária do quarto mamilo inguinal (Figura 2C). As células tumorais foram injetadas de forma controlada nas bolsas de gordura mamária do quarto mamilo inguinal (Figura 2D). O crescimento tumoral foi inicialmente detectado pela palpação digital das bolsas de gordura. Posteriormente, a progressão do volume tumoral foi rastreada quantitativamente por meio de ressonância magnética (RM) (Figura 2E). Tanto o peso corporal (Figura 2F) quanto os volumes tumorais (Figura 2G) foram medidos semanalmente para monitorar flutuações no peso e progressão dos volumes tumorais. Os tumores foram inspecionados visualmente para monitorar feridas como ulceração que exigiriam interrupção prematura. O enxerto bilateral bem-sucedido do PDX nas bolsas de gordura mamárias inguinais é mostrado na Figura 2H, e as bolsas de gordura após a excisão dos tumores são mostradas na Figura 2I.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig2.jpg"> 
Figura 2: Preparação de camundongos, injeção de PDX e monitoramento da progressão do tumor. (A) As bolsas de gordura mamárias foram completamente depiladas. (B) Apresentação do local de injeção com visibilidade clara das áreas de injeção alvo. (C) Posição da seringa na almofada de gordura, normalmente 0,5-1 mm caudal à almofada de gordura, dependendo do comprimento da agulha. A seta branca indica a área alvo da agulha ao inserir. (D) Representação da injeção de células dissociadas na almofada de gordura mamária do quarto mamilo inguinal esquerdo. A agulha deve ser mantida em um ângulo de aproximadamente 45 graus, conforme mostrado para a injeção. (E) Imagem representativa de ressonância magnética de tumores enxertados bilateralmente no local da injeção. Os tumores são destacados em verde. (F) Progressão representativa dos pesos corporais em gramas após a injeção de células tumorais (n = 5). A linha azul escura representa a regressão linear simples, que é significativamente diferente de zero (p &lt; 0,0001); Os camundongos ganharam, em média, 22 mg.dia-1. O sombreamento azul escuro é um intervalo de confiança de 95%, o sombreamento azul claro é um intervalo de previsão de 95% e as linhas laranja são medidas longitudinais do peso corporal. (G) Progressão representativa dos volumes tumorais individuais em mm3 após a injeção de células tumorais (n = 10). A linha azul escura representa regressão exponencial; O tempo de duplicação do volume tumoral foi de 19,08 dias. O sombreamento azul escuro é um intervalo de confiança de 95%, o sombreamento azul claro é um intervalo de previsão de 95% e as linhas laranja são volumes tumorais longitudinais. (H) Enxerto bilateral bem-sucedido de células PDX nas bolsas de gordura mamárias inguinais. Observe que a vascularização pode ser observada suprindo cada tumor. As setas brancas identificam os tumores. (I) A área do coxim adiposo mamário inguinal após a excisão de tumores. (H, I) As unidades na régua estão em cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O PDX representativo (PEN_056) originou-se de uma mulher caucasiana de 31 anos com carcinoma mamário invasivo estágio 3A. O tumor primário, coletado da mama direita, apresentava status de receptor de RE e PR negativo, HER2 positivo (ER-PR-HER2+). A coloração IHQ para receptores ER, PR e HER2 mostrou concordância entre o paciente e os tumores PDX (Figura 3). No entanto, o PDX mostra uma maior expressão de HER2, o que pode ser devido a um crescimento seletivo de células HER2+. A avaliação patologista dos cortes corados com H&amp;E confirmou carcinoma pouco diferenciado com morfologia e citologia consistentes nas amostras do paciente e do PDX (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig3.jpg"> 
Figura 3: Coloração do receptor IHC e H&amp;E. (Coluna da esquerda) Coloração IHC dos receptores ER, PR e HER2 e coloração H&amp;E no tumor do paciente. As colorações de RE e PR não mostram coloração positiva evidente, como esperado. As colorações de HER2 exibem positividade para HER2 (marrom). (Coluna da direita) Coloração IHC dos receptores ER, PR e HER2 e coloração H &amp; E na amostra PDX passada. A coloração do receptor se assemelha muito à observada na amostra do paciente, embora o HER2 mostre maior expressão após a passagem. Barra de escala: 50 μm; Ampliação: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A genotipagem de repetição curta em tandem (STR) confirmou &gt;80% de similaridade entre os 13 loci autossômicos definidos pelas diretrizes de consenso ASN-0002-2022 da American Type Cell Culture Collection (ATCC) mais 3 loci adicionais (Tabela 1). O sequenciamento de RNA em massa (RNA-seq) da amostra de tumor do paciente e o PDX confirmaram níveis equivalentes de alinhamento ao genoma de referência humano mais recente (T2T CHM13v2.0), com 82,3% e 79,1% de alinhamento de leituras, respectivamente. Além disso, o tumor do paciente e o PDX mostraram uma forte correlação positiva com um valor de r de Pearson de 0,9559 (Figura 4A). A análise de enriquecimento do conjunto de genes comparando PDX vs tumor do paciente revelou que as 10 principais vias significativamente enriquecidas de processos biológicos de ontologia gênica eram predominantemente conjuntos de genes imunológicos, sugerindo que a maior parte da variação transcricional entre PDX e tumor do paciente deriva da falta de células imunes na amostra PDX (Figura 4B).
<table border="1" fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D5S818</td>
			<td>D13S317</td>
			<td>D7S820</td>
			<td>VWA</td>
			<td>TH01</td>
			<td>SOU</td>
			<td>em TPOX</td>
			<td>CSF1PO</td>
			<td>D3S1358</td>
			<td>D21S11</td>
			<td>D18S51</td>
			<td>Penta_E</td>
			<td>Penta_D</td>
			<td>D8S1179</td>
			<td>FGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor do paciente</td>
			<td>12 13</td>
			<td>8 8</td>
			<td>8 9</td>
			<td>17 17</td>
			<td>9 9.3</td>
			<td>X X</td>
			<td>8 10</td>
			<td></td>
			<td>15 16</td>
			<td>29 31.2</td>
			<td>16 19</td>
			<td>12 13</td>
			<td>14 14</td>
			<td>10 14</td>
			<td>21 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor PDX</td>
			<td>13 14</td>
			<td>8 8</td>
			<td>8 9</td>
			<td>17 17</td>
			<td>9 9.3</td>
			<td>X X</td>
			<td>10 10</td>
			<td></td>
			<td>15 15</td>
			<td>29 29</td>
			<td>16 19</td>
			<td>12 13</td>
			<td>14 14</td>
			<td>10 14</td>
			<td>21 25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Autenticação de repetição curta em tandem (STR).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig4.jpg"> 
Figura 4: Correlação de sequenciamento de RNA e enriquecimento do conjunto de genes. (A) Gráfico de dispersão visualizando as contagens normalizadas log2 por milhão (CPM) para todos os genes do tumor do paciente (eixo x) e PDX (eixo y). Foi encontrada uma forte correlação positiva, com um valor de r de Pearson de 0,9559. (B) Gráficos de crista para os 10 principais conjuntos de genes de processos biológicos de ontologia de genes enriquecidos ao comparar PDX vs. tumor do paciente. As curvas descrevem a distribuição da pontuação de enriquecimento para cada conjunto de genes; color representa o valor q de FDR para cada conjunto de genes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama

Patient-derived xenografts (PDXs) provide a clinically relevant method for recapitulating tumor-involved cell types and the tumor microenvironment, which ...

high-throughput-dissociation-orthotopic-implantation-breast-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Aprenda a técnica de dissociação enzimática e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama em camundongos. Este método de alto rendimento permite estudar respostas sistêmicas a tumores humanos de forma eficiente.

Dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama

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