Name: Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a marcar proteínas com etiquetas de fluorescência em larvas de peixe-zebra para visualizar proteínas de baixa expressão. Este método simplifica a construção de doadores e melhora a imagem em biologia molecular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Marcação de proteína fluorescente em larvas de peixe-zebra usando CRISPR/Cas9 Knock-In

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+imaging+reveals+hidden+oncogenic-normal+cell+communication+during+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis.</a> Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).</li>
<li>Gomes, M. C., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+modeling+human+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The case for modeling human infection in zebrafish.</a> Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Sci Rep. 6, 29490(2016).</li>
<li>He, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ligase+3-dependent+microhomology-mediated+end+joining+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos.</a> Mutat Res. 780, 86-96 (2015).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Sci Rep. 5, 8841(2015).</li>
<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &micro; L&nbsp; dicas</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para todas as manipulações</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para armazenamento e centrifugação de várias soluções Tubos de</td></tr><tr><td>1,5 mL (sem RNase)</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para armazenamento e centrifugação de soluções sem RNase</td></tr><tr><td>10 &micro; L dicas</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para todas as manipulações</td></tr><tr><td>10 &micro; Pontas L (sem RNase)</td> <td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para manipulações sem RNase</td></tr><tr><td>1000 &micro; L&nbsp; dicas (sem RNase)</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para manipulações sem RNase</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tioureia (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Para inibir a melanogênese e manter as larvas transparentes</td></tr><tr><td>200 &micro; L dicas</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para todas as manipulações</td></tr><tr><td>200 &micro; Pontas L (sem RNase)</td> <td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para manipulações sem RNase</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td> <td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR para testes de eficiência de sgRNA</td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Para imagens</td></tr><tr><td>de placas de 6 poços</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para criação individual e temporária de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>Para digestão enzimática</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td>Para preparação de tampão TAE</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Ampicilina, sal de sódio</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Para preparação de tampão embrião</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>Para agulhas geneating para injeção</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Qualquer ID de marca</td><td>(diâmetro interno) = 0,1 mm</td><td>Para quantificar uma gota de 1-nL</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&nbsp; http://www.crisprscan.org/</td> <td>Para design de sgRNA</td></tr><tr><td>DH5 e alfa;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>Para transformação</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Para tampão de lise e preparação de tampão TAE</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>Para encontrar informações genéticas</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>Para purificação e extração de DNA</td></tr><tr><td>Exonuclease III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td></td></tr><tr><td>LIC Micro-injetor a gás Warner</td><td>Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese em gel</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>Para gel Luvas de eletroforese</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer marca</td><td>N / A</td><td>Para todas as manipulações</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td> <td>Plasmídeo CZP3 sgRNA contendo andaime sgRNA</td><td></td></tr> <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Para embrião preparação de tampão</td></tr><tr><td>Solução de precipitação de cloreto de lítio</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>Precipitação de sgRNAs, sem RNase</td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>Para preparação de géis de agarose a 4%</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Banho de metal</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para incubação em temperatura constante</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Para preparação de tampão de embrião</td></tr><tr><td>Molde de microinecção</td><td>Caseiro</td><td>N/A</td><td>Para gerar sulcos para segurar embriões durante a microinjeção</td></tr><tr><td>Microloader, ponta para preenchimento de Femtotips e outros microcapilares de vidro, estéreis, 0,5 &ndash; 20 &micro; L, 100 mm, cinza claro, 192 unid. (2 racks &times; 96 pcs.)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para Carregar a solução de microinjeção na agulha de injeção, sem RNase</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Para gerar agulhas para injeção</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Para todas as manipulações</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para fundição de placa de injeção e géis de agarose</td></tr><tr><td>MinElute PCR Kit de purificação (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>Para purificar produtos de PCR e produtos de digestão,</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 sem RNase Kit de transcrição</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>Transcrição in vitro de mRNA Cas9,</td></tr><tr><td>N2</td><td>Any sem</td> RNase N<td>/A</td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Para tampão de embrião e preparação de tampão de lise</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Para preparação de tampão embrionário</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>Para preparação de tampão TAE</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>Manipulações relacionadas com RNA,</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td> sem RNase <td>Para máquina de PCR de digestão enzimática</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Amplificação de PCR</td></tr><tr><td>Tubos de tiras de PCR</td><td>Qualquer marca</td><td>N / A</td><td>Para</td></tr><tr><td>tubos de PCR</td><td>FEITONGKANG</td><td>blp-200</td><td>Para placa de Petri PCR</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer marca</td><td>N / A</td><td>Para criação de larvas de peixe-zebra etc.</td></tr><tr><td>Vermelho de fenol</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Para microinjeção, sem RNase</td></tr><tr><td>Suporte de pipeta</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>PrimeStar (Premix)</td><td>Takara</td><td>DR040A</td><td>Para clonagem molecular</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>Para extração de DNA genômico</td></tr><tr><td>pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>Modelo de plasmídeo</td> <td>CZP11</td> Cas9</tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Qualquer marca</td><td>N / A</td><td>Para centrifugação relacionada ao RNA</td></tr><tr><td>Escala</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>Para fundição de placa de injeção e géis de agarose</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Qualquer marca</td><td>N / A</td><td>Para cortar caudas de peixes adultos</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A600485</td><td>Para preparação</td></tr> <tr><td>de tampão de liseEscovas pequenas</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para mover suavemente embriões em placas de microinjecção</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Para medições de concentração de ADN/RNA</td></tr><tr><td>Micrómetro de palco</td><td>Qualquer marca</td><td>DIV (Divisão) = 0,01 mm</td><td>Para quantificar uma gotícula de 1 nL</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência estéreo</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Para observação da expressão génica</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Para observação e microinjecção</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Sistema de produção de RNA em grande escala</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Transcrição in vitro de sgRNAs, sem RNase</td></tr><tr><td>Incubadora com temperatura controlada</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para incubação de embriões</td></tr><tr><td>TIDE</td><td>TIDE</td><td>https://tide.nki.nl/</td> <td>Para análise da eficiência do sgRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine metanossulfonato</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Para preparação de solução de tricaína</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>Para solução de tricaína, tampão de lise e preparação de tampão TAE</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Qualquer marca</td><td>N / A</td><td>Para agulhas de injeção de corte</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>Para enzimático digestão</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Sistema de aquário de peixe-zebra</td><td>ESEN</td><td>ESEN-AW-S1</td><td>Para criação de peixes adultos</td></tr><tr><td>Tanques de acasalamento de peixe-zebra (com uma divisória)</td><td>Qualquer marca</td><td>N/A</td><td>Para acasalamento dos peixes</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>Zeiss LSM900</td><td>Para imagens confocais dos peixes marcados com fluorescência e análise de dados</td></tr><tr><td>Site da</td><td>ZFIN ZFIN</td><td>http://zfin.org/</td> <td>Para encontrar informações sobre genes</td></tr></tbody></table>

marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

As junções comunicantes que consistem em proteínas poliméricas chamadas conexinas são essenciais para a troca de metabólitos e íons de baixo peso molecular entre as células em contato. O método de marcação de proteínas fluorescentes descrito acima foi usado para marcar a conexina 39.9 (Figura 5A) e a conexina 44.1 (Figura 5B), respectivamente. O KI correto foi verificado por PCR de junção (Figura 6). De acordo com ...

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Este protocolo delineia uma forma de rótulo e traçar o destino de pequenos grupos de células de embriões zebrafish utilizando UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido por montar todo imunomarcação para amplificar o sinal da fluoresceína uncaged.

Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Manipulações direcionadas para causar estresse direcionado ou morte em células individuais têm sido relativamente difíceis de realizar. Aqui, uma abordagem de ablação com resolução de célula única para estressar e matar seletivamente células individuais em cultura de células e animais vivos é descrita com base em um laser UV confocal padrão.

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Aprenda a marcar proteínas com etiquetas de fluorescência em larvas de peixe-zebra para visualizar proteínas de baixa expressão. Este método simplifica a construção de doadores e melhora a imagem em biologia molecular.

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

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