Name: Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a preparar criosecções de retina de camundongos e realizar imunocoloração de fotorreceptores com morfologia preservada. Este protocolo reprodutível auxilia pesquisadores a estudar doenças retinianas e mecanismos moleculares da degeneração.

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<ol><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+Revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: Revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Usukura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+technique+for+the+observation+of+intracellular+structures+and+immunocytochemistry+of+tissues+in+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning technique for the observation of intracellular structures and immunocytochemistry of tissues in atomic force microscopy (AFM).</a> Sci Rep. 7 (1), 6462(2017).</li>
<li>Park, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+rhodopsin+in+rod+photoreceptor+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of rhodopsin in rod photoreceptor cell membranes.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1361-1376 (2021).</li>
<li>Boonstra, H., Oosterhuis, J. W., Oosterhuis, A. M., Fleuren, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+tissue+shrinkage+by+formaldehyde+fixation%2C+paraffin+wax+embedding%2C+section+cutting+and+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Cervical tissue shrinkage by formaldehyde fixation, paraffin wax embedding, section cutting and mounting.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 402 (2), 195-201 (1983).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Prog Retin Eye Res. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+preparation+of+mouse+retinal+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for preparation of mouse retinal cryosections.</a> Eur J Histochem. 64 (3), 3154(2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+protocol+for+the+preparation+of+mouse+retinal+cryosections+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">A quick protocol for the preparation of mouse retinal cryosections for immunohistochemistry.</a> Open Biol. 11 (7), 210076(2021).</li>
<li>Szel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+topographic+separation+of+two+spectral+classes+of+cones+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 325 (3), 327-342 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>-80 &deg; C freezer</td><td>Haier</td><td>DW-86L626</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de adesão</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Goat anti-Rabbit</td><td>Proteintech</td><td>SA00006-2</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Criosection micrótomo</td><td>Leica</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>LEICA</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td>DAPI</td><td>4083S</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>ZEISS</td><td>3943030830</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Solarbio</td><td>S9100</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de incorporação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção fina</td><td>RWD</td><td>S13001-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora aquosa</td> de <td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Shanghai</td><td>Yuejin</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>de Fluoromount Sigma-Aldrich</td><td>1049330500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1048771000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>FIS-06666</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal a laser</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampa do microscópio Vidro</td><td>CITOTEST</td><td>80340-3610</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1091371003</td><td></td></tr><tr><td>Composto OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolau caneta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-PDE6B</td><td>Proteintech</td><td>22063-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>SCILOGEX</td><td>8042210200</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>BioFroxx</td><td>1245GR500</td><td></td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Deli</td><td>7147S</td><td></td></tr><tr><td>Corda de tênis (1,24 mm)</td><td>Gosen</td><td>TS761</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Macklin</td><td>T831042</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>IT9100</td><td></td></tr></tbody></table>

crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Seguindo o protocolo descrito acima, os olhos de camundongos C57Bl/6J do tipo selvagem com 1 mês de idade foram fixados em PFA a 4%. As amostras fixadas foram então incluídas em OCT e criosseccionadas. Os cortes foram imunomarcados com um anticorpo anti-PDE6B e contracorados com DAPI para marcar os núcleos. PDE6B é uma proteína de fototransdução especificamente expressa em células fotorreceptoras de bastonetes4. Em comparação com os protocolos tradicionais, este protocolo melhora significativament...

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

cryosectioning-and-immunostaining-of-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC).  Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.

Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a preparar criosecções de retina de camundongos e realizar imunocoloração de fotorreceptores com morfologia preservada. Este protocolo reprodutível auxilia pesquisadores a estudar doenças retinianas e mecanismos moleculares da degeneração.

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

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