Name: Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a analisar a estimulação de células T humanas em co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas por radioterapia e inibidores de quinase. Este método avalia a proliferação e expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos Cellstar de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Cellstar de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 6 poços estéril, com tampa</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 96 poços estéril, fundo em F, com tampa</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, Mouse IgG1</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Orange, Rato IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD3e</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, camundongo anti-humano IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, Mouse IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Corante Vermelho Escuro</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE&</td><td>nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Águia Modificada&agudo; s Médio)</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo DxFlex (com carregador automático)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico di-hidratado</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>Para produção de FBS inativado por calor. Aqueça por 30 min a 56 graus; C com mistura para inativar as proteínas do complemento.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (número de versão 9)</td><td>GraphPad</td> <td>Software-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Anticorpo, anti-humano, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (número da versão 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td> <td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina-monocloridrato</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td> <td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solução de estoque</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MS</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem melhorada por Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Médio</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td> <td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL tubos</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td> <td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

análise da atividade de células t humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

As células tumorais HSC4 derivadas de um CECP foram semeadas e incubadas durante a noite. Após 24 h, as células foram tratadas com um inibidor de quinase. Após 3 h, foram aplicadas as duas primeiras doses de 5 Gy por fração. Após 24 h, a segunda dose foi aplicada e as células foram novamente incubadas durante a noite. Paralelamente, 48 h antes do início da co-cultura, as células T foram isoladas do sangue de um doador saudável. Primeiro, os PBMCs foram isolados usando tubos de centrifugação com gradiente de densidade e um meio de separação estéril. As PBMCs foram contadas usando uma câmara de contagem de células e as células T CD8+ foram isoladas usando o kit de isolamento de células T CD8+. As células T CD8+ isoladas foram então coradas com CFSE (1 μM) e posteriormente contadas. As células T foram semeadas em placas de poços pré-revestidas CD3/CD28 com densidade de 1,5 x 106 células/3 mL. Após 48 h de estimulação, as células T foram colhidas, contadas e ressuspensas em uma densidade de 10.000 células/10 μL. Além disso, poços representativos das células tumorais semeadas foram colhidos e contados, e o meio foi trocado por todos os poços restantes. As células T foram adicionadas às células tumorais na proporção de 1:1. A co-cultura foi colhida após 96 h, o sobrenadante foi armazenado a -20 °C e as células foram coradas e medidas por citometria de fluxo (Figura 1).
As células T foram identificadas por exclusão de tamanho e positividade para CD3/CD8. O sinal CFSE de células CD3+/CD8+ positivas mostrou a distribuição de células T não proliferativas (alto sinal CFSE) e subpopulações distintas de células T proliferativas (perda da intensidade do sinal CFSE). A proporção de células T em proliferação foi exemplarmente medida para a linha celular HSC4 HNSCC (Figura 4A). Todas as células T que apresentaram pelo menos uma divisão foram definidas como "proliferativas". As células T que apresentaram mais de 3 divisões foram definidas como "altamente proliferativas" (Figura 4B). Para a linhagem celular HPV-negativa HSC4, um ligeiro aumento na taxa de proliferação foi detectado quando as células T foram co-cultivadas com células tumorais irradiadas. RT e RT mais inibição de ATR resultaram em um aumento significativo da proliferação consecutiva de células T quando comparadas a co-culturas de células HSC4 tratadas com inibição de ATM com células T. Em relação à fração "altamente proliferativa" de células T, o pré-tratamento de células HSC4 com RT mais inibição de ATR foi mais eficaz em estimular a proliferação de células T (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
Figura 4: Proliferação de células T coradas com CFSE para análises de alterações dependentes do tratamento HSC4 na proliferação de células T. (A) Proporção de células T em proliferação após 96h de co-cultura com células tumorais HSC4 negativas para HPV pré-tratadas. A proliferação de células T foi significativamente menor após a co-cultura com células tumorais HSC4 tratadas com RT + ATMi quando comparada ao tratamento com RT ou RT mais ATRi. (B) RT de células tumorais HSC4 induziu uma fração maior de células T altamente proliferantes (mais de três divisões celulares. Após a co-cultura de células tumorais HSC4 pré-tratadas com RT + ATRi com células T, a porcentagem de células T altamente proliferativas foi a mais alta. As barras mostram dados de quatro experimentos independentes com as células T de quatro doadores independentes e saudáveis (n = 4; Média ± DP). (*p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001, ****p≤ 0,0001; significância estatística testada comparando todas as condições experimentais com cada uma usando Mann-Whitney-U bicaudal para dados não normalmente distribuídos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A perda de CFSE baseada em proliferação pode ser usada para quantificar a taxa de proliferação de células T. Além disso, vários marcadores de superfície celular são descritos como associados à atividade das células T, como CD25 e HLADR. Portanto, foi realizada análise de CD25 e HLA-DR na superfície de todas as células T CD3+ e CD8+ por citometria de fluxo (Figura 5). A expressão pode ser quantificada se subpopulações distintas de CD25alto ou HLA-DRalto forem detectáveis e puderem ser discriminadas por gating dessas células altamente positivas ( Figura 3B ). Se nenhuma subpopulação distinta for detectável, a intensidade média de fluorescência (MFI) de toda a população pode ser medida e os deslocamentos baseados na condição do MFI podem ser quantificados (Figura 3C).
Exemplarmente, a expressão identificada pelo MFI de CD25 e HLA-DR foi analisada após 96 h de co-cultura com células tumorais HSC4 pré-tratadas (Figura 5). Após a co-cultura de células T com células tumorais HSC4 tratadas com RT, a expressão de CD25 nas células T foi fortemente regulada negativamente. Notavelmente, o pré-tratamento das células tumorais apenas com ATMi resultou em uma expressão significativamente diminuída de CD25 quando comparado ao pré-tratamento com ATRi. No cenário combinado com RT, embora a RT tenha resultado em diminuição da expressão de CD25 nas células T, a combinação de RT com ATMi resultou em um aumento da expressão de CD25 quando comparada a RT mais ATRi (Figura 5A). Em relação à expressão de HLA-DR em células T, o RT geralmente levou à regulação positiva do HLA-DR, mas, novamente, em combinação com ATMi ou ATRi, um comportamento diferente foi observado (Figura 5B). As células T co-cultivadas com células HSC4 que foram pré-tratadas com uma combinação de RT+ATRi aumentaram a expressão de HLA-DR em comparação com RT sozinho ou RT+ATMi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
Figura 5: Expressão dos marcadores de ativação CD25 e HLA-DR na superfície das células T após 96 h de co-cultura com células tumorais HSC4 pré-tratadas. A expressão de CD25 e HLA-DR foi analisada com base no deslocamento do MFI de toda a população de células T. A RT de HSC4 resultou em uma diminuição da expressão de CD25 nas células T e um aumento da expressão de HLA-DR. A combinação de RT com ATMi resultou em padrões de expressão significativamente diferentes quando comparados a RT mais ATRi. Os boxplots mostram dados de quatro experimentos independentes com as células T de quatro doadores independentes e saudáveis (n = 4; Média ± DP). Os dados foram analisados comparando todas as condições experimentais entre si usando um teste bicaudal de Mann-Whitney-U para dados normalmente não distribuídos (*p≤ 0,050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Esses dados indicam exemplarmente que o tratamento de células tumorais, neste caso de células HSC4 HNSCC, impacta a imunogenicidade das células tumorais. Isso pode ser monitorado pelo co-cultivo das células tumorais com células T pré-estimuladas, o que leva a um comportamento diversificado de proliferação e expressão de marcadores de ativação em células T humanas com base no regime de tratamento de células tumorais aplicado.

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Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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