Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

As células tumorais alteram o fenótipo imunológico durante a terapia, o que pode afetar o resultado e, portanto, o objetivo de nossa pesquisa é investigar a interação entre células T e células tumorais para criar uma melhor compreensão dessas interações.

Aumentar a sensibilidade do rádio, particularmente em tumores radiorresistentes, combinando radioterapia com inibidores de quinase. Direcionar a resposta a danos no DNA é atualmente uma parte central dos desenvolvimentos recentes. Modelos tridimensionais de cultura celular e modelos de co-cultura estão atualmente estabelecidos no campo da radiobiologia para aumentar a comparabilidade entre dados in vitro e in vivo.

[Narrador] Para começar, obtenha células tumorais HSC4 em um volume adequado de meio D10. Semeie pelo menos três poços por condição, cada um contendo 15.000 células em 200 microlitros de meio em placas de 96 poços. Designe uma placa para tratamento de amostra, incluindo poços apenas para controle de células tumorais e apenas células T e poços para contagem de células para cada tratamento no dia da co-cultura. No segundo dia, trate as células tumorais com inibidores de quinase nas concentrações necessárias. Irradiar uma placa após três a quatro horas e a mesma após 24 horas de incubação com cinco cinzas para irradiação hipofracionada. Para células mononucleares de sangue periférico, ou isolamento PBMC, transfira o sangue misturado de EDTA coletado de um doador saudável para dois tubos de centrifugação de 50 mililitros. Encha os dois tubos de centrifugação até 50 mililitros com PBS e 2% de FBS. Em seguida, prepare seis tubos de centrifugação com incrustações de plástico para separação de PBMC. Encha cada um com 15 mililitros de meio gradiente de densidade fria. Cubra cuidadosamente o meio de gradiente de densidade com 12 a 15 mililitros de sangue diluído. Centrifugar os tubos a 1.200 G durante 10 minutos sem desaceleração. Após centrifugação, transferir o sobrenadante para quatro novos tubos de centrifugação de 50 ml. Descarte os tubos usados. Encha os novos tubos de centrifugação até 50 mililitros com PBS e 2% de FBS e centrifugue a 120 G por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de PBS contendo 2% de FBS e combine os dois pellets em um tubo de falcão. Encha o tubo de centrifugação a 50 mililitros novamente com PBS contendo 2% de FBS. Centrifugue os PBMCs a 300 G por 10 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 80 microlitros de MACS mais tampão por 10 elevado a sete células. Adicione 20 microlitros de microesferas CD8 por 10 à potência de sete células e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo. Incube por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as células com dois mililitros de MACS mais tampão por 10 à potência de sete células. Centrifugue o tubo a 300 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em 1000 microlitros de MACS mais tampão. Coloque duas colunas MS no ímã e coloque dois tubos de centrifugação de 15 mililitros embaixo. Equilibre as colunas com 500 microlitros de MACS mais buffer. Em seguida, coloque um volume igual da suspensão de células na coluna MS preparada. Enxágue as colunas com 500 microlitros de MACS mais tampão três vezes. Rotule as células finais coletadas como fluxo ou CD8 negativo e combine-as em um único tubo de centrifugação. Em seguida, pegue um novo tubo de centrifugação de 15 mililitros rotulado com células T CD8 positivas. Lave ambas as colunas contendo células T CD8 positivas marcadas magneticamente com 1000 microlitros de MACS mais tampão cada. Antes de corar as células T, centrifugue-as a 300 G por cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1000 microlitros de PBS. Centrifugar novamente a suspensão a 300 g durante cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 2000 microlitros de uma solução micromolar de coloração CFSE. Incube por 20 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugue as células coradas a 300 G por cinco minutos. Depois de lavar as células com PBS, ressuspenda-as em meio de células T. Semeie as células na placa de seis poços revestida com CD3 e CD28 e incuba. No quarto dia, colha as células T e ressuspenda-as em seu respectivo meio. Adicione o número desejado de células T aos poços de células tumorais na proporção de um para um após a contagem dos poços designados. No sétimo dia, remova a placa de cultura da incubadora para quantificação da proliferação de células T. Depois de lavar as células, core-as com os anticorpos desejados e faça citometria de fluxo para avaliar as células T. Exclua a população de gibões com base na área de dispersão direta versus a altura de dispersão direta para obter singletos. Plote os singlets para identificar células T com base na área de dispersão direta versus a área de dispersão lateral. Plote a expressão CD3 em relação à área de dispersão lateral para discriminar as células T. Além disso, identifique as células T CD8 positivas depois de traçar o sinal CD8 contra a área de dispersão lateral. Todas as células T devem expressar CD3 e CD8. Plote o sinal CFSE de todas as células T CD8 positivas como um histograma. Depois de concluir as etapas de gating, selecione células T CD8 positivas como entrada e analise sua expressão de isotipo CD25 ou HLA-DR plotando a respectiva fluorescência do marcador de superfície em relação à área de dispersão lateral. A proporção de células T proliferativas aumentou quando co-cultivadas com células tumorais HSC4 irradiadas. A radioterapia ou RT e RT mais inibição de ATR aumentaram significativamente a proliferação de células T em comparação com RT mais inibição de ATM. Entre as células T altamente proliferativas, a inibição de RT mais ATR foi a mais eficaz em estimular a proliferação. A expressão de CD25 em células T foi regulada negativamente após co-cultura com células tumorais HSC4 tratadas com RT. O pré-tratamento de células tumorais com inibidor de ATM sozinho diminuiu significativamente a expressão de CD25 em comparação com o inibidor de ATR. A combinação de RT e inibidor de ATM resultou em aumento da expressão de CD25 em comparação com RT mais inibidor de ATR. A expressão de HLA-DR em células T foi geralmente regulada positivamente por RT. A co-cultura com células HSC4 pré-tratadas com RT mais inibidor de ATR aumentou ainda mais a expressão de HLA-DR em comparação com RT sozinho ou RT mais inibidor de ATM.