Name: Uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos de laboratório (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Aprenda uma técnica eficiente de amostragem de leite em camundongos para pesquisa de lactação usando um dispositivo de vácuo. Este método permite coleta de 0,1–0,5 mL em menos de 10 minutos por uma única pessoa, minimizando perdas amostrais.

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Todos os procedimentos experimentais e de cuidados com os animais seguiram as diretrizes federais e receberam a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Rutgers. Camundongos fêmeas (C57BL / 6 background) foram acasalados com 8 semanas de idade. Eles foram alimentados com ração reprodutora padrão ad libitum e mantidos em um ciclo regular de 12:12 h claro: escuro. O dia do parto foi contado como dia 1 pós-parto (PD1). No PD2 (início da lactação) e no PD10 (pico da lactação), o leite foi amostrado conforme descrito a seguir.
1. Montagem de um dispositivo de ordenha 
<ol>
	<li>Prenda uma extremidade do tubo de cloreto de polivinila (PVC) de 5/32 '' de diâmetro interno (ID) à bomba de vácuo e use fita adesiva para prender o acessório (identificado como a na Figura 1A). NOTA: A bomba de vácuo pode ser substituída por qualquer bomba adequada ou por um aspirador central (às vezes chamado de "aspirador doméstico") disponível no laboratório.</li>
	<li>Conecte a outra extremidade do tubo de PVC de 5/32 '' ID ao tubo de PVC de 1/8 '' ID por meio de um conector reto farpado.</li>
	<li>Prenda a outra extremidade do tubo de PVC de 1/8 '' ID a uma agulha hipodérmica 18G por meio de um conector (identificado como b na Figura 1A).</li>
	<li>Corte a extremidade de uma ponta de pipeta P200 ~0.2 cm para criar uma abertura maior. Insira a ponta da pipeta P200 através da abertura da rolha do septo de forma que a ponta aponte para cima (Figura 1B). NOTA: Troque as pontas da pipeta entre os animais.</li>
	<li>Conecte a rolha de septo a um tubo coletor estéril. Faça uma punção através da rolha do septo com a agulha hipodérmica 18 G.</li>
	<li>Verifique a pressão de sucção girando a bomba de vácuo e colocando um dedo (coberto por uma luva de laboratório) contra a abertura da ponta da pipeta. NOTA: Você deve sentir uma sucção suave se estiver montado corretamente. O tubo coletor, a agulha hipodérmica de 18 G e as pontas da pipeta P200 devem ser estéreis.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67669/67669fig1.jpg"> 
Figura 1: O dispositivo de ordenha. (A) Dispositivo de ordenha com uma bomba de vácuo conectada a uma agulha hipodérmica de 18 G por meio de tubo de PVC. A agulha passa por uma rolha de septo que é conectada a um tubo coletor de microcentrífuga. Uma ponta de pipeta P-200 invertida, que é usada para extrair leite de um teto, é inserida através de uma abertura da rolha do septo. (B) Diagrama transversal do dispositivo de ordenha. (C) Uma mãe sendo ordenhada usando o método descrito. (D) Uma alíquota representativa (0,3 mL) de leite coletada de uma mãe no pico da lactação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67669/67669fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Separação da mãe dos filhotes
<ol>
	<li>No dia da ordenha, separe a mãe de seus filhotes para permitir o acúmulo de leite nas glândulas.</li>
	<li>Mantenha os filhotes aquecidos em um ninho.</li>
	<li>Aguarde 2 h de separação se o leite for coletado durante o início da lactação (por exemplo, PD2 neste estudo).</li>
	<li>Aguarde 30 a 45 minutos de separação se o leite for coletado durante o pico da lactação (por exemplo, PD10 neste estudo).</li>
</ol>
3. Anestesia da barragem
<ol>
	<li>Quando a mãe estiver pronta para ser ordenhada, administre uma injeção de solução de cetamina/xilazina (intraperitoneal, i.p.) em um lado da cavidade peritoneal entre o4º e o5º par de tetinas. NOTA: A quantidade de solução anestésica a ser administrada é calculada pelo peso da barragem (80–100 mg/kg de cetamina, 5–12 mg/kg de xilazina, de acordo com o protocolo IACUC da Rutgers University). Esta dose sedará um camundongo por 45 a 60 minutos, proporcionando tempo suficiente para a coleta de leite.</li>
	<li>Confirme a anestesia apertando um pé com firmeza, mas sem machucá-lo, para testar a percepção do animal sobre sensação e dor. A anestesia adequada é indicada por nenhum tipo de movimento.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos da barragem para evitar o ressecamento durante a anestesia.</li>
</ol>
4. Coleta de leite
<ol>
	<li>Coloque a barragem anestesiada de costas em uma superfície de trabalho sólida. Limpe suavemente a área mamária com um lenço de preparação com álcool estéril para limpar a área antes da ordenha.</li>
	<li>Administre 1–2 unidades de ocitocina (i.p.) entre o4º e o5º par de no lado da cavidade peritoneal que não recebeu nenhuma injeção. NOTA: A ocitocina é uma molécula pequena que pode ser absorvida rapidamente e tem meia-vida curta 14,15. A ordenha deve começar dentro de um minuto após a injeção.</li>
	<li>Segure a barragem esfregando suavemente a área do pescoço com a mão não dominante.</li>
	<li>Extraia manualmente o leite de uma tetina apertando o tecido mamário da base até a ponta da tetina até que uma gota de leite fique visível.</li>
	<li>Ligue o dispositivo de aspiração ligando o botão liga/desliga.</li>
	<li>Comece a ordenhar aplicando suavemente a ponta da pipeta P200 invertida em uma tetina. Use um movimento suave de puxar para ajudar a retirar o leite (Figura 1C).</li>
	<li>Repita os passos 4.4–4.6 em todas as tetinas até que seja recolhido um volume suficiente de leite. NOTA: Durante a ordenha, o leite pode ser acidentalmente aspirado para a agulha hipodérmica de 18 G ou tubo de PVC da linha de vácuo. Isso pode ser facilmente remediado trocando a agulha ou o tubo de PVC antes de ordenhar o próximo animal.</li>
</ol>
5. Recuperação da barragem após a coleta de leite
<ol>
	<li>Devolva a mãe anestesiada para a gaiola com seus filhotes e mantenha-a aquecida. Monitore o animal até que ele recupere a consciência. NOTA: A mãe pode se recusar a mamar novamente se ela puder acordar sozinha em uma gaiola separada antes de retornar aos filhotes. Isso é mais comum quando a coleta de leite ocorre durante o início da lactação (PD2).</li>
	<li>Deixe as mães se afastarem de seus filhotes para se recuperar totalmente quando ela começar a acordar; Este é um comportamento normal. NOTA: Observamos que as mães retornam aos seus filhotes periodicamente e voltam a amamentar completamente após algumas horas.</li>
</ol>
6. Análise do leite
<ol>
	<li>Use um kit comercial de ensaio de lactose (consulte a Tabela de Materiais) para medir a lactose do leite. Diluir o leite 75x com água estéril e realizar o ensaio de acordo com o protocolo do kit.</li>
	<li>Medir a gordura do leite pelo método do crematócrito demonstrado em outras publicações16,17.</li>
	<li>Estimar a proteína do leite realizando o ensaio de proteína de Bradford18 com albumina de soro bovino como padrão19. Antes de realizar o ensaio, centrifugue o leite a 4.000 × g por 15 min a 4 °C. Extrair o infranadante pipetando e diluí-lo a 1:10 com água estéril antes do ensaio.</li>
	<li>Realizar eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE); separe 10 μg de proteína em um gel Bis-Tris pré-moldado a 4% a 12%, conforme as instruções do fabricante. Transfira as proteínas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e core-as com Coomassie Blue R-250.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Método otimizado de uma única pessoa para coleta de leite em estudos de lactação de camundongos

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<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+The+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mo+Med%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).</li>
<li>Watford, M., Erbelding, E. J., Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+rat+small+intestine%3A+Response+to+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in rat small intestine: Response to lactation.</a> Biochem Soc Trans. 14 (6), 1058-1059 (1986).</li>
<li>Robinson, A. M., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+glucose+metabolism+in+the+lactating+mammary+gland+of+the+rat+in+vivo+and+in+vitro.+Effects+of+starvation%2C+prolactin+or+insulin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of glucose metabolism in the lactating mammary gland of the rat in vivo and in vitro. Effects of starvation, prolactin or insulin deficiency.</a> Biochem J. 164 (1), 153-159 (1977).</li>
<li>Kowalski, T. J., Wu, G., Watford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+adipose+tissue+amino+acid+metabolism+in+vivo+as+assessed+by+microdialysis+and+arteriovenous+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rat adipose tissue amino acid metabolism in vivo as assessed by microdialysis and arteriovenous techniques.</a> Am J Physiol. 273 (3 Pt 1), E613-E622 (1997).</li>
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<li>Hallemeesch, M. M., Ten Have, G. A., Deutz, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+measurements+across+portal+drained+viscera%2C+liver%2C+kidney+and+hindquarter+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux measurements across portal drained viscera, liver, kidney and hindquarter in mice.</a> Lab Animal. 35 (1), 101-110 (2001).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Frascos criogênicos de 1 mL</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>Preferido para coleta precoce de leite</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Exel</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>Tubo coletor de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-344</td><td>Preferido para coleta de leite de pico e tardia</td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica de 18 G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica de 27 G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Toalhete de preparação de álcool</td><td>Honeywell</td><td>154818</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membrana</td><td>Immobilon</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td>Comprado via Veternarian Office&nbsp;</td></tr><tr><td>Fita de rotulagem de laboratório</td><td>VWR International</td><td>89097</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK487</td><td></td></tr><tr><td>Mini Conexões de polipropileno farpado</td><td>Cole-Parmer Instrument Company</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Dieta de camundongos</td><td>Lab Diet</td><td>5015</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4&ndash; 12%</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare Eye Lube</td><td>Aventix</td><td>N/A</td><td>Comprado via Veternarian Office&nbsp;</td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Bimeda</td><td>1OXY015</td><td>Comprado via Veternarian Office&nbsp;</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta P200</td><td>Gilson</td><td>F1733001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PVC: 1/8'' ID</td><td>VWR International</td><td>MFLX07407-75&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PVC: 5/32'' ID</td><td>VWR International</td><td>MFLX07407-77</td><td></td></tr><tr><td>Rolha de septo</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-3022-91</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-103635</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn Animal Health</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Comprado via Veternarian Office&nbsp;</td></tr></tbody></table>

uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos de laboratório

An Efficient Single-Person Technique for Milk Sampling from Laboratory Mice

Usando esta técnica, amostramos com sucesso leite suficiente em diferentes momentos durante uma lactação de 21 dias. Consideramos o dia do parto como o dia 1 pós-parto (PD1) e, neste trabalho, amostramos leite no PD2 (início da lactação) e PD10 (pico da lactação), n = 4 cada. Obtivemos confortavelmente 0,1–0,5 mL de leite de cada mãe (Figura 1D). Para validar esse método, medimos a composição bruta de macronutrientes dessas amostras de leite e comparamos as diferenças entre o leite coletado no início e no pico da lactação usando o teste t de Student.
Observou-se que a concentração média de lactose no leite foi de 12,3 ± 0,6 g/L no PD2 e de 12,0 ± 0,9 g/L no PD10 (Tabela 1). O percentual de gordura do leite foi de 26,0 ± 1,0% e 33,4 ± 2,5% no PD2 e PD10, respectivamente. A concentração de gordura foi de 174,4 ± 7,1 g/L no PD2 e significativamente maior, 224,4 ± 17,1 g/L no PD10 (Tabela 1). Os teores médios de proteína foram de 70,1 ± 5,2 g/L no PD2 e 75,1 ± 2,6 g/L no PD10 (Tabela 1). Embora o teor total de proteína do leite não tenha sido diferente entre PD2 e PD10, a abundância relativa de proteína individual do leite diferiu. Especificamente, a αS1-caseína e a proteína ácida do soro de leite foram maiores no leite PD10 do que no leite PD2 (p &lt; 0,05), enquanto a β-caseína (p &lt; 0,05) apresentou maior abundância no PD2 do que no PD10 (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67669/67669fig2.jpg"> 
Figura 2: Análise da proteína do leite. (A) Análise PAGE corada com azul de Coomassie do leite coletado em PD2 e PD10. A identificação da proteína foi feita conforme descrito anteriormente14. (B) Os sinais de proteínas individuais foram analisados no ImageJ e normalizados para a proteína total corada. Os resultados foram expressos como a média com barras de erro padrão e pontos de dados individuais como pontos. A abundância média de cada proteína em PD2 e PD10 foi comparada usando um teste t de Student bicaudal. *p &lt; 0,05, n = 4. Abreviaturas: PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida; PDn = dia pós-parto n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67669/67669fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Média</td>
			<td>SEM</td>
			<td>Valor de p</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Lactose (g/L)</td>
			<td>PD2</td>
			<td>12.3</td>
			<td>0.6</td>
			<td rowspan="2">0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD10</td>
			<td>12.0</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Gordura (g/L)</td>
			<td>PD2</td>
			<td>174.4</td>
			<td>7.1</td>
			<td rowspan="2">0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD10</td>
			<td>224.4</td>
			<td>17.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Proteína (g/L)</td>
			<td>PD2</td>
			<td>70.1</td>
			<td>5.2</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD10</td>
			<td>75.1</td>
			<td>2.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Composição de macronutrientes do leite coletado em PD2 e PD10. Os resultados, expressos como média e erro padrão da média (EPM), foram analisados para examinar os efeitos do dia de lactação na composição do leite usando um teste t de Student bicaudal, n = 4.

Uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos de laboratório

Rodent models have been widely used in biology since the early 20th century to study basic physiology and biochemical mechanisms. In lactation and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

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Punção venosa da veia facial para coleta de sangue murino

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Uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos de laboratório

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