Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

Nossa pesquisa explora como os GPCRs influenciam o tráfego e o posicionamento de células imunes em vários microambientes de tecido. Usando este protocolo e outros protocolos complementares, nosso laboratório identificou um eixo quimioatraente específico do órgão nos tecidos da mucosa não intestinal. Então, agora, descobrimos como os linfócitos, lar do estômago, pulmão, traqueia e trato GU. Estou apresentando um método eficiente e aprimorado para testar como os GPCRs individuais afetam o movimento das células T in vivo. Desenvolvemos uma maneira confiável de introduzir esses receptores nas células T, que agora permitem a comparação direta lado a lado em ensaios de homing competitivos. Agora que sabemos como os GPCRs guiam as células T in vivo, os pesquisadores podem conectar melhor a expressão do receptor à função imunológica. Isso ajudaria os pesquisadores em imunologia básica, bem como em pesquisa terapêutica. Com essa abordagem, podemos agora perguntar como os GPCRs menos conhecidos ou não caracterizados estão envolvidos na orientação das células T para tecidos específicos. Podemos aprender como a sinalização GPCR pode ser ajustada para tratar câncer ou autoimunidade. Podemos ajudar as células T a chegar ao lugar certo na hora certa para abordagens terapêuticas.

[Narrador] Para começar, no primeiro dia, cubra as placas de cultura de tecidos de 10 centímetros com cinco mililitros de 50 microgramas por mililitro de solução de poli-D-lisina preparada em água estéril. Incube as placas em temperatura ambiente por 45 minutos e, em seguida, lave as placas duas vezes com PBS estéril sem cálcio e magnésio para garantir que nenhum resíduo permaneça. Em seguida, separe as células Plat-E usando dois mililitros de tripsina a 0,05% e EDTA 0,5 milimolar a 37 graus Celsius por três minutos. Para garantir a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de azul de tripano, misture um volume igual da suspensão celular com solução de azul de tripano. Em seguida, semeie 3 milhões de células vivas em uma placa de Petri de cultura de tecidos de 10 centímetros com meio Plat-E livre de antibióticos. No segundo dia, substitua o meio nas culturas de células Plat-E por 6,5 mililitros de meio sérico reduzido. Prepare a mistura de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Para cada placa, misture 45 microlitros de Lipofectamine 2000 com 210 microlitros de meio de soro reduzido em um tubo e 15 microgramas de DNA com 235 microlitros de meio de soro reduzido em outro tubo. Combine o conteúdo dos tubos pipetando três a quatro vezes e incube por 20 minutos em temperatura ambiente para facilitar a formação complexa. Agora, adicione a mistura gota a gota às placas e incube por 16 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, revestir placas de 24 poços para ativação de células T com CD28 e CD3 anti-camundongo em 375 microlitros por poço de PBS. Incube as placas durante a noite a quatro graus Celsius ou por três a quatro horas em uma incubadora ajustada a quatro graus Celsius. No terceiro dia, use um êmbolo de seringa para esmagar suavemente os baços de camundongos isolados em um filtro de células de malha de náilon de 100 micrômetros colocado em uma placa de seis poços contendo meio RPMI. Transfira a suspensão celular através de um filtro de célula de malha de nylon de 40 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros para obter uma suspensão de célula única. Centrifugue a solução a 450 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células com PBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, execute a seleção magnética negativa usando o kit de isolamento de células T CD4 de camundongo de acordo com as instruções do fabricante. Conte a célula T isolada usando um contador de células. Plaquear as células T nos poços de ativação de células T revestidos a uma densidade de um a 1,5 milhão de células por poço em um mililitro de meio RPMI 10. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada por 24 a 48 horas. No quarto dia, colete aproximadamente 12 mililitros de sobrenadante viral das placas de 10 centímetros em um tubo cônico. Substitua o meio nas placas de cultura Plat-E por 10 mililitros de meio Plat-E sem antibióticos para gerar mais sobrenadante viral para uma segunda transdução no dia seguinte. Para filtrar o sobrenadante viral coletado, passe-o por um filtro de seringa de 0,45 micrômetro. Adicione oito microgramas por mililitro de Polybrene e uma diluição de 100 de tampão HEPES ao sobrenadante filtrado. Gire a placa de células T de 24 poços por sete minutos a 950g. Em seguida, colete e guarde cuidadosamente o sobrenadante sem desalojar as células T. Para realizar a spinfecção, adicione um mililitro de sobrenadante viral a cada poço. Sele as placas com filme plástico e gire as placas a 1.150g por quatro horas a 32 graus Celsius. Após a infecção, substitua cuidadosamente o meio em cada poço pelo sobrenadante de células T salvo anteriormente. No sexto dia, colete as células T da placa em um tubo cônico e centrifugue. Lave o pellet com PBS contendo cálcio e magnésio. Transfira as células para uma nova placa de cultura contendo 130 unidades por mililitro de interleucina-2 de camundongo e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-7 de camundongo. Incube as células por pelo menos dois dias ou até que atinjam o nível de expansão desejado com base no número de células necessárias para a injeção. No oitavo dia, centrifugue a 450g por cinco minutos a quatro graus Celsius para peletar as células. Adicione cinco mililitros de Histopaque-1077 em um tubo de 15 mililitros. Ressuspenda o pellet de células T em cinco mililitros de PBS contendo cálcio e magnésio. Coloque cuidadosamente a suspensão celular em cima de cinco mililitros de Histopaque-1077 no tubo da centrífuga. Centrifugue a amostra a 400 a 500g por 20 minutos em temperatura ambiente, garantindo que a quebra ou aceleração da centrífuga esteja definida como 0. Após a centrifugação, observe a formação de camadas celulares distintas. Colete cuidadosamente a camada de interface contendo as células desejadas usando uma pipeta, evitando a contaminação com outras camadas. As células T transduzidas por GPR25 exibiram migração aprimorada para hCXCL17 e mCXCL17 em relação aos controles transduzidos por stuffer, validando a expressão funcional do receptor. O GPR25 transduziu células preferencialmente localizadas em tecidos da mucosa não intestinal, como trato geniturinário, estômago e traqueia, com enriquecimento significativo observado em sete semanas, mas não em uma semana após a injeção. Ensaios de homing de curto prazo mostraram que o GPR25 transduziu células T preferencialmente alojadas em órgãos ricos em Cxcl17, como traqueia, estômago, língua, vesícula biliar e mucosa uterina, enquanto não se acumulava em camundongos deficientes em Cxcl17. O GPR25 transduziu células predominantemente localizadas em brônquios, enquanto as células de controle foram encontradas com mais frequência perto de veias.