Name: Detecção rápida de virulência e tipagem de Helicobacter pylori usando a tecnologia de marcação de pontos quânticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Aprenda a usar a tecnologia de pontos quânticos para detecção rápida e tipagem de virulência de Helicobacter pylori. Este método de imunocromatografia in vitro permite diagnósticos precisos e planos de tratamento individualizados.

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Este estudo (KY2025-191-01) foi realizado de acordo com as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do Hospital Popular da Província de Guangdong (Academia de Ciências Médicas de Guangdong), Southern Medical University. Este artigo está em conformidade com o pedido de isenção do consentimento informado.
NOTA: Este estudo tem como objetivo usar a tecnologia de pontos quânticos para projetar e desenvolver um kit para diagnosticar se as espécies sanguíneas dos participantes contêm anticorpos de urease (Urease) de Helicobacter pylori , anticorpos vacuolares de citotoxina A (VacA) e anticorpos de toxina do gene A () relacionados à citotoxina para determinar se H . pylori está infectado e se a cepa infectada é tipo I ou tipo II. Este kit projetado usa um método de sanduíche de antígeno duplo para medir anticorpos Helicobacter pylori Urease, anticorpos e anticorpos VacA. Quando a amostra de teste contendo a substância alvo é adicionada à almofada de amostra, ela flui através da almofada quântica e da membrana por meio da ação do sifão, formando um complexo antígeno-anticorpo em fase sólida. Após a detecção, a linha de detecção e a massa são lidas, respectivamente, pelo analisador. O valor do sinal da linha de controle é usado para determinar o status negativo e positivo do anticorpo Urase, anticorpo e anticorpo VacA com base nos valores de sinal T/C de cada um dos três anticorpos. O diagrama de projeto é mostrado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67792/67792fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático do cartão de teste de digitação de H. pylori . A figura mostra a estrutura e composição do cartão de teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67792/67792fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Preparação do kit
<ol>
	<li>Estabelecimento do sistema de reação tampão do ácido etanossulfônico (MES) QDs-2-(n-morfina)<ol>
		<li>Equilibre a solução original de QDs à temperatura ambiente (RT). Em seguida, aspire 1000 μL e adicione um volume igual de solução 2x MES (a concentração final de MES foi de 10 mmol / L).</li>
		<li>Misture, agite e sonice por 30 s a 3 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ativação<ol>
		<li>Adicione 20 mg / mL de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxisuccinimida (NHS) no sistema tampão QDs-MES na proporção de 10: 1. Misture, agite e sonice por 3 min.</li>
		<li>Colocar a solução preparada num banho-maria a 37 °C durante 15 min e centrifugar a 13.000 × g durante 20 min.</li>
		<li>Remova o sobrenadante da solução centrifugada e dissolva-o novamente com 1x solução MES. Sopre a solução repetidamente com uma pipeta, agite para misturar uniformemente e sonice por 3 min.</li>
		<li>Colocar a solução acima em banho-maria a 37 °C durante 15 min e centrifugar a 13.000 × g durante 20 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Acoplamento<ol>
		<li>Adicione 0,03 mg de antígeno Urease, antígeno, antígeno VacA e IgG anti-camundongo de cabra a 1000 μL da solução de ativação, pipete a ponta repetidamente, agite e sonice por 3 min.</li>
		<li>Colocar a solução acima referida num banho-maria a 37 °C e reagir durante 3 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fechamento e armazenamento<ol>
		<li>Adicione 100 μL de solução de bloqueio (Tabela Suplementar 1) e incube por 1 h.</li>
		<li>Centrifugar a solução bloqueada a 13.000 × g durante 15 min.</li>
		<li>Retirar o sobrenadante da solução centrifugada, adicionar 750 μl de solução de reconstituição (Tabela Suplementar 1), pipetar repetidamente, agitar e sonicar durante 5 min e conservar a 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparação de placas revestidas
<ol>
	<li>Preparação de almofadas quânticas<ol>
		<li>Diluir o complexo de antígenos H . pylori marcado com pontos quânticos 1:5 com tampão de diluição de pontos quânticos para preparar a quantidade necessária de acordo com a produção em lote.</li>
		<li>Pegue a almofada quântica e pulverize uniformemente uma certa quantidade de complexo de antígeno H . pylori marcado com pontos quânticos na almofada usando um pulverizador de filme e seque a 37 ° C por 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação da membrana<ol>
		<li>Use o buffer de impressão para diluir a linha de controle e os materiais de revestimento da linha de teste e prepare a quantidade necessária de acordo com o volume de produção do lote.</li>
		<li>Cole a membrana de nitrocelulose na placa de cloreto de polivinila (PVC), use um pulverizador de ouro para revestir uniformemente a linha de controle de qualidade e os materiais da linha de teste na membrana e seque a 57 ° C por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montagem
<ol>
	<li>Cole o quantum e sample pads na placa de PVC revestida por filme em sequência.</li>
</ol>
4. Corte em tiras
<ol>
	<li>Use um cortador de tiras para cortar a placa grande montada em tiras de teste.</li>
</ol>
5. Embalagem interna
<ol>
	<li>Complete a embalagem de acordo com os requisitos de composição do kit. NOTA: Os componentes do kit são os seguintes: (i) Cartão de teste: Consiste em um invólucro de tira de teste e uma tira de teste. A tira de teste consiste em uma placa de PVC, uma almofada de amostra, uma almofada quântica (um complexo de antígeno marcado com pontos quânticos; o complexo contém antígeno Urease, antígeno, antígeno VacA e IgG de camundongo), uma membrana de nitrocelulose (a área de detecção é fixada com antígeno VacA, antígeno e antígeno Urease (expressão eucariótica de antígeno recombinante) e a área de controle de qualidade é revestida com IgG anti-camundongo caprino (anticorpo poli caprino)), e papel absorvente. Diferentes especificações de embalagem têm diferentes quantidades de cartão de teste. É necessário um cartão de teste para o reagente de uma pessoa. (ii) Cartão SD: 1 peça/caixa. Os componentes do cartão de teste e do cartão digital seguro (SD) de diferentes lotes de kits de teste não devem ser misturados.</li>
</ol>
6. Processamento de amostras
NOTA: Para coleta de amostras, consulte os Procedimentos Operacionais do Laboratório Clínico Nacional.
<ol>
	<li>Colete sangue em um tubo de gel de separação. Tome cuidado para evitar hemólise.</li>
	<li>Testar a amostra de soro separada em 4 h à temperatura ambiente (RT). Se não puder ser testado a tempo, armazene a amostra a 2-8 °C por 3 dias. Para longo prazo (dentro de 1 ano), sele e armazene-o abaixo de -20 °C.</li>
	<li>Restaure as amostras para RT e misture-as bem antes de usar. NOTA: As amostras congeladas e descongeladas devem ser completamente descongeladas antes do uso, e o número de ciclos de congelamento e descongelamento não deve exceder cinco. Amostras repetidas congeladas e descongeladas podem causar a deterioração do analito e devem ser evitadas. Amostras graves de quilo e hemólise também afetarão o teste e devem ser evitadas.</li>
</ol>
7. Procedimento para o teste
<ol>
	<li>Retire o kit de reagentes e os materiais de controle de qualidade para equilibrar o RT.</li>
	<li>Preparação da amostra: Centrifugue as amostras de sangue total a 1467 g por 10 min.</li>
	<li>Verifique se o número do lote do cartão SD corresponde ao do kit de reagentes. Insira o cartão SD no instrumento para calibração automática.</li>
	<li>Ligue o instrumento e o computador operacional. Inicie o software designado e selecione o módulo de teste . Escolha Configurações de inicialização para inicializar o instrumento e aguarde a conclusão bem-sucedida.</li>
	<li>Acesse a área de reagente do instrumento e remova o slot do cartão de teste. Abra o kit de reagentes e selecione o número necessário de cartões de teste.</li>
	<li>Abra as bolsas de alumínio dos cartões de teste e coloque-as no slot de acordo com a orientação indicada. Reinsira o slot de cartão na área de reagente do instrumento.</li>
	<li>Teste de controle de qualidade (CQ)<ol>
		<li>No módulo Teste , selecione Entrada Manual. Clique em Entrada de informações e insira as informações específicas do material de CQ. Clique em Gerar. Coloque os materiais de controle de qualidade no rack de amostras designado, garantindo a ordem e orientação corretas.</li>
		<li>Clique em Iniciar teste para iniciar o teste de CQ. A agulha de amostra do instrumento aspirará 80 μL da amostra e a dispensará verticalmente no poço da amostra. O instrumento começará a cronometrar automaticamente após a distribuição da amostra. Após 15 min, o instrumento realizará a detecção, lerá os valores de medição e emitirá os resultados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Teste de amostra: no módulo Teste , selecione LIS bidirecional. Coloque as amostras a serem testadas no suporte de amostras designado, garantindo a ordem e orientação adequadas. Clique em Iniciar teste. O instrumento aspirará 80 μL de amostra de cada um e os processará de forma idêntica ao processo de controle de qualidade.</li>
	<li>Assim que o teste for concluído, remova os cartões de teste usados do instrumento e descarte-os como lixo médico.</li>
</ol>
8. Controle de qualidade
<ol>
	<li>H. pylori negativo: Verifique e certifique-se de que os resultados dos produtos de referência negativos para Helicobacter pylori , ou seja, anticorpo Urease, anticorpo e anticorpo VacA, são todos negativos.</li>
	<li>Infecção por H. pylori tipo II: Verifique e certifique-se de que o produto de referência do Helicobacter pylori tipo II, ou seja, o anticorpo Urease, seja positivo e os resultados do anticorpo e do anticorpo VacA sejam todos negativos.</li>
	<li>Infecção por H. pylori tipo I: Verifique e certifique-se de que o produto de referência Helicobacter pylori tipo I, ou seja, o anticorpo Urease é positivo, o anticorpo e/ou o anticorpo VacA são positivos.</li>
</ol>
9. Análise dos resultados
<ol>
	<li>Infecção tipo II com cepas fracas ou não toxigênicas: Quando a leitura do anticorpo Urease é positiva e as leituras do anticorpo e do anticorpo VacA são negativas, interprete-a como uma infecção por uma cepa fraca ou não toxigênica de H. pylori .</li>
	<li>Infecção tipo I com cepas produtoras de toxinas altamente patogênicas: Quando a leitura do anticorpo Urease é positiva e a leitura do anticorpo ou do anticorpo VacA é positiva, ou ambos são positivos, interprete-a como uma infecção por uma cepa produtora de toxina H . pylori altamente patogênica.</li>
	<li>Negativo: Quando as leituras do anticorpo Urease, anticorpo e anticorpo VacA forem todas negativas, interprete-o como nenhuma infecção por cepas de H. pylori .</li>
	<li>Inválido: Quando o instrumento julgar o resultado como inválido, verifique se há operação incorreta ou falha do kit de reagentes e tente o procedimento novamente.</li>
</ol>
10. Calibração do analisador de fluorescência
<ol>
	<li>Primeiro, ligue o analisador e deixe-o aquecer por cerca de 15 minutos para estabilizar seu desempenho. Em seguida, insira o padrão de calibração fornecido pelo fabricante no porta-amostras.</li>
	<li>Em seguida, acesse a função de calibração na interface do analisador e inicie o processo. O analisador detectará automaticamente a fluorescência do padrão e ajustará seus parâmetros internos de acordo para corresponder aos valores de referência predefinidos.</li>
	<li>Depois disso, remova o padrão de calibração e insira uma amostra em branco para verificar se as leituras estão dentro da faixa aceitável.</li>
	<li>Repetir regularmente essas etapas de acordo com o cronograma recomendado ajuda a manter a precisão do analisador para medições confiáveis.</li>
</ol>

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<li>Purwidyantri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+graphenebased+microfluidic+sensor+for+DNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable graphenebased microfluidic sensor for DNA detection.</a> Sens Actuators B Chem. 367, 132044(2022).</li>
<li>Lee, K. S., Wagner, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ramanbased+sorting+of+microbial+cells+to+link+functions+to+their+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell%22%5BJournal%5D)">Ramanbased sorting of microbial cells to link functions to their genes.</a> Microb Cell. 7 (3), 62-65 (2020).</li>
<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+carbon+dots+for+energy+conversion+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of carbon dots for energy conversion and storage.</a> Chem Soc Rev. 48 (8), 2315-2337 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida cloridrato (EDC)</td> <td>Sigma</td><td>25952-53-8</td><td>5 g / frasco</td></tr><tr><td>2- (n-morfina) ácido etanossulfônico (MES)</td> <td>Sigma</td><td>145224-94-8</td><td>100 g / garrafa</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sigma</td><td>3K15</td><td></td></tr><tr><td>Analisador Imuno de Fluorescência</td><td>Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd</td><td>Província de Guangdong Registro de dispositivo médico nº. </td><td></td>2017221743</tr><tr><td>Kit de Teste de Tipagem Helicobacter pylori&nbsp;</td><td>Chongqing iSIA BIO-Technology Co., Ltd</td><td>Registro nacional de dispositivos médicos nº 20203400330</td><td>QDs Método de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Sal de sódio de N-hidroxitiosuccinimida (NHS)</td> <td>Sigma</td><td>106627-54-7</td><td>1 g / frasco</td></tr></tbody></table>

detecção rápida de virulência e tipagem de helicobacter pylori usando a tecnologia de marcação de pontos quânticos

Rapid Detection of Helicobacter pylori Virulence and Typing Using Quantum Dot Labeling Technology

A Figura 2 mostra o princípio de funcionamento do imunoanalisador de fluorescência de pontos quânticos. Consiste principalmente em uma fonte de luz de excitação, uma fonte de luz receptora, um módulo de circuito de conversão fotoelétrica, um circuito de processamento de sinal, um circuito de conversão de valor AD e um módulo de cálculo de processamento de sinal; A fonte de luz de excitação gera marcadores fluorescentes. Ele absorve luz monocromática com comprimento de onda semelhante, e a lu...

Detecção rápida de virulência e tipagem de Helicobacter pylori usando a tecnologia de marcação de pontos quânticos

We present a method based on quantum dot labeling technology for rapidly detecting the virulence of Helicobacter pylori and performing typing, aiming to ...

rapid-detection-helicobacter-pylori-virulence-typing-using-quantum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O protocolo apresenta um método não invasivo para o diagnóstico rápido de infecções estomacais pelo Helicobacter pylori através do teste de cordas e determina sua resistência antibiótica à claritromicina e levofloxacina usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).

Diagnóstico Rápido Baseado na Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) da Infecção por Helicobacter pylori e Resistência a Antibióticos

Um método rápido e preciso para detecção de H. pylori e teste de resistência a medicamentos é muito significativo para erradicar eficientemente o H. pylori na prática clínica. Este protocolo tem como objetivo apresentar uma metodologia específica envolvendo a reação em cadeia da polimerase quantitativa da mucosa gástrica (qPCR) para a detecção rápida de H. pylori e resistência a antibióticos.

Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase da mucosa gástrica para detecção de Helicobacter pylori e resistência a antibióticos

O protocolo emprega uma amostragem de fezes não invasiva combinada com uma reação em cadeia da polimerase quantitativa para oferecer um método de diagnóstico conveniente e rápido para a infecção por Helicobacter pylori e sua resistência à claritromicina e quinolonas.

Detecção de infecção por Helicobacter pylori e resistência a antibióticos por meio da análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase nas fezes

Neste estudo, uma técnica de detecção em sanduíche baseada em anticorpos duplos foi desenvolvida para detecção rápida de antígenos fecais infectados com Helicobacter pylori.

Detecção rápida de antígeno fecal da infecção por Helicobacter pylori com base na tecnologia de detecção de sanduíche de anticorpo duplo

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda...

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

A rápida e precisa de teste ponto-of-care para a aspergilose pulmonar invasiva é apresentado. Leva vantagem de fluxo lateral-tecnologia, utilizando um anticorpo monoclonal específico que se liga a...

Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

Este artigo ilustra o uso de marcação de rádio de perseguição de pulso em combinação com fotocrosslinking específico do local para monitorar as interações entre uma proteína de interesse e outros fatores em E. coli. Ao contrário dos métodos tradicionais de reticulação química, essa abordagem gera "instantâneos" de alta resolução de uma via de montagem ordenada em uma célula viva.

Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

Aqui descrevemos um método para visualizar a organela bacteriana oncogênica conhecida como Sistema de Secreção Cag Tipo IV (Cag-T4SS).  Descobrimos que o Cag-T4SS é produzido diferencialmente na superfície de H. pylori em resposta a condições variáveis de disponibilidade de ferro.

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da Helicobacter pylori Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células cancerosas, o que representa um potencial biomarcador câncer relevante. Utilizando tecnologia de sensor livre de marcador e do receptor de células T imitando anticorpos monoclonais, a detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada, permitindo o desenvolvimento de um romance câncer plataforma de diagnóstico.

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

As culturas derivadas de células-tronco abrigam um tremendo potencial para modelar doenças infecciosas. Aqui, a cultura de organoides gástricos de camundongos e humanos derivados de células-tronco adultas é descrita. Os organoides são microinjetados com o patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Aprenda a usar a tecnologia de pontos quânticos para detecção rápida e tipagem de virulência de Helicobacter pylori. Este método de imunocromatografia in vitro permite diagnósticos precisos e planos de tratamento individualizados.

Detecção rápida de virulência e tipagem de Helicobacter pylori usando a tecnologia de marcação de pontos quânticos

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