Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

A capacidade de obter imagens da vasculatura cerebral e registrar a dinâmica do fluxo sanguíneo no cérebro intacto de roedores vivos é uma técnica poderosa que pode ser aplicada ao estudo da isquemia cerebral ou da fisiologia cerebral normal. Aqui, demonstraremos como usar duas microscopias fotográficas para obter imagens da dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos vivos usando corantes fluorescentes injetados na veia da cauda. Esta técnica foi originalmente desenvolvida por David Kleinfeld em Winfred Dank.

Olá, sou Ricardo Mota do Laboratório de Carlos Porter Cayo no Departamento de Neurologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Em um vídeo anterior, mostramos o método para implantar uma janela craniana para experimentos de imagem crônica in vivo. Hoje vamos mostrar o procedimento para obter imagens da dinâmica do fluxo sanguíneo no córtex cerebral através de uma janela craniana.

Essa preparação é muito útil porque permite obter imagens profundas do cérebro usando a microscopia a laser de fótons. Então, vamos começar. Para obter imagens da vasculatura cerebral, os animais devem ser injetados por via intravenosa com um corante fluorescente.

Usamos corantes conjugados Dexter porque o dextron moty evita que o corante atravesse a barreira hematoencefálica e vaze para fora dos vasos sanguíneos. Os camundongos são anestesiados com éde flúor, 4% para indução e 1,5 a 2% durante a injeção. Em seguida, a cauda é desinfetada com três cotonetes de álcool 70% com uma agulha de calibre 26, 75 a cem microlitros de uma solução de 5% de R domine Dextran dissolvido em solução salina é injetado através da veia da cauda.

No meio do caminho ao longo do eixo dos animais da cauda podem ser fotografados imediatamente após a injeção da veia da cauda até que a matriz seja excretada na urina, que ficará rosa se estiver usando corante de domina ERO Em cerca de duas horas após a injeção de corante fluorescente de Dexter, o camundongo é anestesiado com isof flúor. Novamente, 4% para indução, um a 1,5% para imagem. O mouse é firmemente preso usando a barra de titânio ao estágio do microscópio, que contém uma almofada de aquecimento regulada termicamente para manter o animal aquecido.

Um pouco de pomada para os olhos é aplicada para manter os olhos úmidos. A lamínula da janela craniana é limpa com álcool 70%. A janela é posicionada paralelamente ao plano focal e centralizada no campo de visão.

Sob o objetivo de quatro x, é melhor tirar uma fotografia dos vasos da superfície cerebral com uma câmera digital. Esta imagem será usada como imagem de referência nas sessões de imagem seguintes para encontrar a região da imagem repetidamente no dia a dia. A objetiva de quatro x é então substituída por uma objetiva de imersão em água de 40 x.

Sem mover o palco, a imagem digital da vista é tirada. Novamente, as coordenadas do manipulador de estágio são definidas em zero. Usamos a imagem de varredura como software de aquisição de imagem.

Isso foi escrito no MATLAB por Tom Paul Rudo e Bernardo Sabatini no laboratório de Carls Voto. Em seguida, ligamos todos os outros equipamentos, o laser, o medidor de potência, os tubos fotomultiplicadores, os amplificadores, etc. A área da janela adequada para ser fotografada é brevemente escaneada com baixa ampliação para encontrar as melhores regiões.

Uma vez identificados, a pilha de baixa ampliação da região escolhida para a imagem é tirada e suas coordenadas XY são anotadas para registrar a dinâmica do fluxo sanguíneo em pequenos vasos ou capilares. Usamos varreduras de linha ao longo de pelo menos 40 mícrons da embarcação de interesse. Essas varreduras únicas com duração de um segundo são feitas usando o mínimo de energia do laser possível, e as coordenadas e o ângulo de varredura são anotados.

Terminada a sessão de imagem, o animal é transferido para uma câmara quente onde pode se recuperar da anestesia. Aqui mostramos uma pilha de cem imagens tiradas a cada cinco mícrons com nosso microscópio de dois fótons através de uma janela craniana colocada sobre o córtex somatossensorial de um camundongo de cinco meses de idade que foi injetado com r Domine dextran através da veia da cauda. Esta sequência de imagens mostra a complexa rede de vasos sanguíneos grandes e pequenos, incluindo capilares.

Acabamos de mostrar a você um método para visualização da dinâmica do fluxo sanguíneo in vivo através de uma janela craniana. Este é um método extremamente poderoso para obter imagens da dinâmica do fluxo sanguíneo cerebral na vasculatura cortical, por exemplo, para investigar alterações no fluxo sanguíneo após o AVC. Múltiplas imaginações podem ser feitas em vários momentos em BULs usando injeções repetidas na veia da cauda do corante fluorescente.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de trabalhar nas condições mais limpas e estéreis possíveis e ter uma mão muito firme. Ok, e é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.