Name: Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda a imaginar a dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos vivos usando microscopia de dois fótons e janela craniana. Este método permite estudos crônicos da vasculatura cerebral e fisiologia neural.

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Cauda veia injeções de corantes fluorescentes dextranos <ol><li> De modo a vasculatura cerebral imagem, os animais devem ser injetados por via intravenosa com um corante fluorescente. Usamos dextran-conjugados corantes porque a molécula de dextran impede a tintura de atravessar a barreira hematoencefálica e vazando dos vasos sanguíneos. </li><li> Os ratos são anestesiados com isoflurano (4% para a indução, 1,5-2% durante a injeção). </li><li> Cauda é desinfetada com álcool 70%. </li><li> Com uma agulha de calibre 26, 75-100 mL de uma solução 5% v / v de rodamina dextran dissolvido em solução salina é injetada através da veia da cauda, ​​a meio caminho ao longo do eixo da cauda. </li><li> Os animais podem ser visualizados imediatamente após a injeção veia da cauda até a tintura é excretada na urina, que irá transformar-de-rosa, se utilizando um corante rodamina em cerca de 2 horas. </li></ol> Imagem do fluxo sanguíneo através de dois fótons de microscopia (duração total 30-60 min por sessão, dependendo do número de navios com imagens) <ol><li> Após a injeção de corante fluorescente dextran, o mouse é anestesiado com isoflurano (4% para a indução, 1-1,5% para geração de imagens). </li><li> Mouse está firmemente ligado usando a barra de titânio para o estágio do microscópio, que contém uma almofada de aquecimento termo-regulada para manter o animal aquecido. Alguns pomada é aplicada para manter os olhos úmidos. </li><li> A tampa de vidro da janela cranial é limpa com álcool 70%. </li><li> A janela é posicionada paralelamente ao plano focal e centrado no campo de visão no âmbito do objectivo 4X. </li><li> É melhor para tirar uma fotografia dos vasos superfície do cérebro com uma câmera digital. Esta imagem será usada como imagem de referência em seguir as sessões de imagem para encontrar a região fotografada várias vezes no dia a dia. </li><li> O objetivo 4X é substituído com o objetivo de imersão em água 40X sem se mover no palco. Uma imagem digital do campo de visão é tomada novamente. As coordenadas no manipulador estágio são fixados em zero. </li><li> Usamos scanimage como o software de aquisição de imagem. Isto foi escrito em MatLab por Tom Pologruto e Sabatini Bernardo no laboratório de Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). A seguir, ligue todos os outros equipamentos: o laser, o medidor de energia, os tubos foto multiplicadores, os amplificadores, etc </li><li> A área da janela adequada a ser trabalhada é brevemente digitalizadas em baixa ampliação para encontrar as melhores regiões. Uma vez que estes são identificados, uma pilha de baixa ampliação da região escolhida para a imagem é tirada, e coordena a sua XY são anotadas. </li><li> Para gravar dinâmica do fluxo de sangue nos pequenos vasos capilares ou usamos scans linha ao longo de pelo menos 40 mM do navio de interesse. Estes single &quot;varre&quot; um segundo duradoura são feitas utilizando-se como potência do laser mínimo possível e as coordenadas e ângulo de varredura são escritos para baixo. </li><li> Assim que a sessão de imagem é longo, o animal é movido a uma câmara quente, onde ele pode se recuperar da anestesia. </li></ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

Dinâmica do fluxo sanguíneo cortical pode ser estudada in vivo por corantes fluorescentes imagem dextran injetado na veia da cauda dos roedores com dois fótons de microscopia. Este vídeo mostra um método de imagem como a dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos através de um vidro coberto de preparação janela craniana.

<table><tbody><tr><td>Dextrana isotiocianato de fluoresceína</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>massa mol 500,000</td></tr><tr><td>Dextrana isotiocianato de rodamina B</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>massa mol ~70,000</td></tr></tbody></table>

um método para 2-photon imagens de fluxo de sangue no neocórtex através de uma janela cranial

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

A capacidade de imagem da vasculatura cerebral (a partir de navios de grande porte para capilares) e dinâmica registro de fluxo sanguíneo no cérebro dos roedores que vivem intacta é uma técnica poderosa. In vivo utilizando dois fótons de microscopia através de uma janela cranial é possível corantes fluorescentes imagem injetada por via intravenosa. Isto permite uma imagem para a vascularização cortical e também para obter medidas de fluxo sanguíneo. Esta técnica foi desenvolvida originalmente por David Kleinfeld e Winfried Denk. O método pode ser usado para estudar a dinâmica do fluxo sanguíneo durante ou após a isquemia cerebral, em doenças neurodegenerativas, em tumores cerebrais, ou na fisiologia normal do cérebro. Por exemplo, ela tem sido usada para estudar como acidente vascular cerebral provoca mudanças na direção do fluxo do sangue e alterações na velocidade de glóbulos vermelhos ou fluxo em e ao redor do infarto. Aqui demonstramos como usar dois fótons de microscopia para a dinâmica do fluxo sanguíneo imagem no neocórtex de ratos vivos usando corantes fluorescentes injetadas na veia da cauda.

Dinâmica do fluxo sanguíneo cortical pode ser estudada in vivo por corantes fluorescentes imagem dextran injetado na veia da cauda dos roedores com 2-fótons microscopia. Este vídeo mostra como a dinâmica do fluxo sanguíneo na imagem neocórtex de ratos através de um vidro coberto de preparação janela craniana.

Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

A capacidade de imagear a vasculatura cerebral (desde grandes vasos até capilares) e registrar a dinâmica do fluxo sanguíneo no cérebro intacto de roedores vivos é ...

A capacidade de imaginar a vasculatura cerebral e registrar a dinâmica do fluxo sanguíneo no cérebro intacto de roedores vivos é uma técnica poderosa que pode ser aplicada ao estudo da isquemia cerebral ou da fisiologia normal do cérebro. Aqui demonstraremos como usar dois microscópios fotônicos para imaginar a dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos vivos, utilizando corantes fluorescentes injetados na veia da cauda. Esta técnica foi originalmente desenvolvida por David Kleinfeld em Winfred Dank.Olá, sou Ricardo Mota do Laboratório de Carlos Porter Cayo, do Departamento de Neurologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Em um vídeo anterior, mostramos a vocês o método para implantar uma janela craniana para experimentos crônicos de imagem in vivo. Hoje vamos mostrar o procedimento para imagens da dinâmica do fluxo sanguíneo na córtex cerebral por meio de uma janela craniana.Este preparo é muito útil porque permite imaginar profundamente dentro do cérebro utilizando microscopia a laser de dois fótons. Então vamos começar. Para imaginar a vasculatura cerebral, os animais devem ser injetados intravenosamente com um corante fluorescente.Utilizamos corantes con

a-method-for-2-photon-imaging-blood-flow-neocortex-through-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo e protocolo de demonstrar como a implantação de um vidro coberto janela craniana em roedores. Estas preparações podem ser usados ​​para doenças crônicas in vivo de dois fótons de imagens do neocórtex em escalas de tempo de meses. Também pode ser utilizado para outros tipos de imagem, incluindo imagens sinal óptico intrínseco.

Um procedimento de cirurgia Craniotomia para Brain Imaging crônica

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a...

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Fonte: Bisht, K., et al. Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuroimune em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de fluorescência da dinâmica neuroimune em um camundongo transgênico com implante de crânio. A estabilidade vascular e neuronal é visualizada juntamente com as alterações microgliais dinâmicas, refletindo as respostas imunes à atividade neuronal.

Imagem de fluorescência da dinâmica neuroimune usando um implante de crânio

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.

Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

Aprenda a imaginar a dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos vivos usando microscopia de dois fótons e janela craniana. Este método permite estudos crônicos da vasculatura cerebral e fisiologia neural.

Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

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