Name: Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos de síndrome de Noonan usando Danio rerio e microscopia FRET ao vivo. Este protocolo valida variantes patogênicas e testa inibidores MEK.

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<ol><li>Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%2FMAPK+signalling+in+the+developing+brain%3A+Perturbations+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences.</a> Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).</li>
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<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531 (2), 245-249 (2002).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Plásticos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 L Aquário de Reprodução - Design estilo praia</td><td>Tecniplast</td><td>1,7L INCLINADO</td><td>Aquário reprodutor</td></tr><tr><td>Capilares GC100F-10</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>30-0019</td><td>Microinjeção embrionária em estágio unicelular</td></tr><tr><td>Placas de Cultura Celular e de Tecidos - 12 poços</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011012</td><td>Coleta e tratamento de embriões</td></tr><tr><td>Placas de Cultura Celular e de Tecidos - Poço 6</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td>Coleta e tratamento de embriões</td></tr><tr><td>Prato de Cultura Celular</td><td>SPL Ciências da Vida</td><td>20100</td><td>Coleta de embriões &nbsp;</td></tr><tr><td>Pratos de Vidro Nunc 12mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150680</td><td>Imagem espectral FRET do embrião</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Corning</td><td>357524</td><td>Transferência embrionária</td></tr><tr><td>Tubos Lobind de Proteína 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td><forte>Reagentes e outros</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caviar 500-800 & micro; m</td><td>Rettenmaier Italia</td><td>BE2269 (500-800)</td><td>Ração seca para peixes</td></tr><tr><td>Cistos de Artemia Azul do Grande Lago Salgado</td><td>Sanders</td><td>00004727</td><td>Alimento para peixes vivos</td></tr><tr><td>Sal Oceânico Instantâneo</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td>Sal marinho desidratado para preparo de alimentos vivos</td></tr><tr><td>Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Adolescente)</td><td>Contatos para pedidos*: Projeto Nacional de Recursos Biológicos Zebrafish, Unidade de Apoio para o Desenvolvimento de Recursos Animais, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japão. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *na assinatura da MTA.&nbsp; </td><td>-</td><td>Fornecedor da linha de peixe-zebra ERK Reporter. Embriões de peixe podem ser obtidos mediante assinatura MTA do Projeto Nacional de Recursos Biológicos do Japão para peixe-zebra (RIKEN, Japão). A linha do peixe-zebra é depositada pelo Instituto de Ciência e Tecnologia de Nara (Takaaki Matsui) e pelo Instituto Nacional de Genética (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patente para o sistema Tol2) (Wong et al., 2018; Urasaki et al., 2006, Okamoto e Ishioka, 2010).</td></tr><tr><td>6x corante de carga</td><td>Sinalização de Celular</td><td>B7024S</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Escada de DNA a 100 pb</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,01,236</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Agarose, baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Montagem embrionária para imagem espectral FRET e ensaio IHC</td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td>Componente médio E3</td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td>Componente de solução de estoque Danieau</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Componente tampão TBE para preparação de gel</td></tr><tr><td>Etanol 99%+</td><td>Fisher Scientific</td><td>10048291</td><td>Purificação in vitro de RNA</td></tr><tr><td>Formaldeide 16%</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Fixação embrionária</td></tr><tr><td>Formamida & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II (PÁGINA de Desnaturação)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM8546G</td><td>Transcrição in vitro de RNA</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>Componente tampão TBE para preparação de gel</td></tr><tr><td>Glicerol &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-camundongo para cabras</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 anti-coelho para bodes</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21070</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Componente de solução de estoque Danieau</td></tr><tr><td>KpnI - HF (Enzima + Buffer rCutSmart)</td><td>NEB</td><td>R3142</td><td>Linearização plasmídica &nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Componente médio E3/componente de solução Danieau</td></tr><tr><td>Marcadores de RNA do Milênio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7150</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Kit de Purificação de DNA Genômico Monarch</td><td>NEB</td><td>T3010L</td><td>Linearização plasmídica &nbsp;</td></tr><tr><td>MAPK monoclonal de camundongos p44/42</td><td>Sinalização de Celular</td><td>4696S</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Kit de Transcrição mMACHINE SP6 &nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td>Transcrição in vitro de RNA</td></tr><tr><td>Soro normal de cabra (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Ambion de água livre de nuclease</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Transcrição in vitro de RNA</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>Inibidor MEK</td></tr><tr><td>Solução de fenol vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>Componente da mistura de microinjeção &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Rejeitos Poly A</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td>Transcrição in vitro de RNA</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Componente médio E3/componente solução Danieau em estoque/componente de solução original PBS</td></tr><tr><td>Dihidrofosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Componente de solução de estoque PBS</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Fosfo-p44/42 policlonal de coelho MAPK&nbsp;</td><td>Sinalização de Celular</td><td>4695S</td><td>Ensaio IHC</td></tr><tr><td>Coloração segura de gel de DNA para SYBR</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-M</td><td>Componente médio E3/componente solução Danieau em estoque/componente de solução original PBS</td></tr><tr><td>Dibásico fosfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>Componente de solução de estoque PBS</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Componente tampão TBE para preparação de gel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Componente buffer PBSTr</td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alliance Mini HD9&nbsp;</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Sistema de imagem</td></tr><tr><td>Centrífuga 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000205</td><td>Microcentrífuga</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Montagem embrionária &nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 4x</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Sistema de microinjeção</td></tr><tr><td>Infinite M Plex&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>-</td><td>Leitor de placas multimodo</td></tr><tr><td>Leica M205FA</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Microscópio estereoscópico de fluorescência</td></tr><tr><td>Leica TCS-SP8X equipada com incubadora (OkoLab)</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Microscópio confocal</td></tr><tr><td>Sistema de Eletroforese Horizional GT Mini-Subcélula &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>PC-100 Puxador vertical</td><td>Narishige</td><td>-</td><td>Puxador de agulha</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação Universal PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td>Elecroforese em gel</td></tr><tr><td>Stellaris 5&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Microscópio confocal</td></tr><tr><td>Vortex MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>-</td><td>Preparação de plasmídeos</td></tr><tr><td><forte>Softwares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>Licença CC-BY 4.0</td><td>Elaboração de desenhos animados para figuras</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2019</td><td>-</td><td>Análises de dados</td></tr><tr><td>Software de Fiji</td><td>ImageJ</td><td>15.3t</td><td>Renderização por imagem e análises quantitativas (medições de sinais de FRET, intensidade de fluorescência ERK no ensaio IHC, comprimento dos eixos do embrião)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td>GraphPad Software LLC</td><td>v. 9</td><td>Análises estatísticas de dados</td></tr><tr><td>Software de espectrofotômetro iControl</td><td>Tecan</td><td>v. 2.0</td><td>Quantificação de RNA</td></tr><tr><td>Ilustrador</td><td>Adobe</td><td>26.0.3 (64 bits)</td><td>Montagem de figuras</td></tr><tr><td>Software LASX</td><td>Leica Microsystems</td><td>v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)</td><td>Aquisição de imagem para experimentos espectrais de FRET e imagem de embriões para medições de comprimento de eixos</td></tr><tr><td>Software Q9 Mini 18.02-SN</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Aquisição de imagem em gel</td></tr></tbody></table>

um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de erk em modelos iniciais da síndrome de noonan do peixe-zebra por meio de microscopia fret ao vivo e imunofluorescência

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

an-efficient-protocol-to-assess-erk-activity-modulation-early

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra um ensaio não invasivo para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra. Ao medir o enrolamento da cauda nos embriões como resultado da despolarização espontânea dos neurônios motores da medula espinhal, um bloqueador dos canais de sódio é aplicado para reduzir a frequência de enrolamento Em seguida, os embriões são imobilizados em agarose e colocados sob um microscópio de fluorescência. Os neurônios motores geneticamente modificados...

Uma abordagem não invasiva para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Apresentamos um método para a análise eletrorretinográfica (ERG) de larvas de peixe-zebra utilizando técnicas de micromanipulação e eletrorretinografia. Este é um método simples e direto para testar a função visual de larvas de peixe-zebra in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e a caracterização de um modelo de zebrafish de epilepsia resultante da inibição transitória do gene DEPDC5.

Análise comportamental e fisiológica em um modelo de zebrafish de epilepsia

Este manuscrito descreve um método simples para medir o stress comportamentalmente no zebrafish adulto. A abordagem tira proveito da tendência inata que zebrafish preferem a metade inferior de um tanque quando em um estado estressante. Nós igualmente descrevemos métodos para acoplando o ensaio com farmacologia.

Abordagens comportamentais para estudar estresse inato em zebrafish

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) é um método baseado em biologia química para a investigação da sinalização de pequenas moléculas reativas. Esta técnica pode ser aplicada a peixes vivos de diferentes estágios de desenvolvimento. Aqui, acoplamos ensaios padrão em zebrafish com Z-REX para análise de vias de sinalização.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

A manipulação optogenética de vias de sinalização pode ser uma estratégia poderosa para investigar como a sinalização é decodificada no desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso de ativadores de sinalização nodal e proteína morfogênica óssea (BMP) baseados em luz-oxigênio-voltagem no embrião inicial do peixe-zebra.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

Aprenda a avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos de síndrome de Noonan usando Danio rerio e microscopia FRET ao vivo. Este protocolo valida variantes patogênicas e testa inibidores MEK.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

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