Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Geramos modelos de peixe-zebra de doenças complexas do desenvolvimento, ligando o sequenciamento do paciente à genômica funcional, para apoiar a interpretação de variantes e também testes pré-clínicos de medicamentos. Apesar da melhoria dos sensores FRET, ainda faltam ensaios robustos in vivo que detectem mudanças patogênicas sutis na sinalização Ras-MAPK com sensibilidade espaço-temporal suficiente. Para começar, coloque a placa personalizada de microinjeção contendo 2%agarose moldada em meio E3 em uma plataforma de trabalho.

Organize e alinhe os ovos de peixe-zebra adolescentes fertilizados na placa para as pistas apropriadas para restringir o movimento dos ovos durante a microinjeção. Recarregue a agulha com dois microlitros de material injetável usando uma micro carregadora. Ajuste as configurações de pressão e tempo para calibrar cada injeção com base na agulha e na qualidade do embrião no dispositivo de microinjeção.

Injete a solução no estágio unicelular dos embriões adolescentes de peixe-zebra. Criar embriões adolescentes microinjetados sob condições controladas de cuidado. Limpe quaisquer óvulos que pareçam turvos ou degenerados dentro de três horas após a deposição.

Aproximadamente quatro horas após a fertilização, usando um microscópio estereoscópico de fluorescência padrão, ajustado para uma faixa de comprimento de onda de 465 a 500 nanômetros. Faça triagem dos embriões para a expressão do repórter de fluorescência. Selecione peixes adolescentes positivos para exames FRET e reserve irmãos negativos para avaliações imunohistoquímicas.

Coloque grupos de embriões de número igual em diferentes poços de uma placa de seis poços. Para iniciar o tratamento, imerga os embriões em três mililitros de meio E3 contendo controle veicular como DMSO ou MEK diluído na concentração desejada. Para começar, derreta a acaliquota de agarose de 1,5% a 2% de baixa fusão em um ThermoMixer a 50 graus Celsius.

Uma vez dissolvida, reduza a temperatura para aproximadamente 30 graus Celsius. Posicione um único embrião positivo de adolescente injetado no centro de um prato inferior de vidro de 35 milímetros para imagem ao vivo. Remova o excesso de meio E3 e adicione uma gota de agarose de baixa derretimento para imobilizar o embrião.

Deixe a agarose polimerizar em temperatura ambiente. Ligue o controlador da incubadora pelo menos uma hora antes da aquisição e ajuste a temperatura para 28 graus Celsius para manter a saúde do embrião. Quando a incubadora estabilizar, coloque a placa de imagem com o embrião no suporte da amostra e use um objetivo seco 10x para visualizar a amostra.

Ligue o laser de íons de argônio e ajuste a potência do laser para 50%. Nas Configurações de Hardware, escolha resolução de profundidade de oito bits para adquirir imagens. Em seguida, no painel de Aquisição, selecione o modo de varredura de detecção espectral xy, gama, lambda, z e defina a imagem formatada para 512 por 512 pixels, velocidade de varredura de 400 hertz e zoom óptico de 0,75. Ative a linha laser de 458 nanômetros do laser de íons de argônio e defina seu valor de intensidade para 8,5%. Depois, selecione um detector híbrido e ajuste sua sensibilidade para um valor de ganho de 500.

Abra o menu suspenso na barra do detector para selecionar a proteína de fluorescência ciano ou curva de emissão ECFP. Para exibir a curva de emissão do YPET, ative um segundo detector. Depois, selecione a curva de emissão da proteína de fluorescência amarela YFP.

Para iniciar aquisições ao vivo, posicione o cursor de detecção na faixa do sinal YFP mais intenso para visualizar a amostra. Defina as posições inicial e final da espessura da amostra na janela LASX do Z-Stack. Defina as propriedades do alcance da varredura gama para começar em 460 nanômetros e terminar em 570 nanômetros do alcance de detecção.

Defina a largura de banda de detecção como cinco nanômetros e o tamanho do passo de varredura como cinco nanômetros. Comece a aquisição do z-stack. Insira e salve dois espectros de emissão de referência adaptados para CFP e YFP no banco de dados de corantes disponível na janela de Configuração para excluir o fluxo espectral.

Selecione o arquivo de imagem espectral resultante da sessão de imagem e abra a janela do processo. Em seguida, na ferramenta de separação de corantes, selecione Separação Espectral de Corantes e configure as configurações para a separação de corantes. Nas listas suspensas à esquerda do diálogo, selecione o novo espectro de emissão CFP na primeira posição e o novo espectro de emissões YFP do banco de dados de espectro.

Na varredura gama das imagens, identifique a imagem com a maior intensidade de sinal. Depois, mova o z-scan para selecionar a seção óptica que destaca a área de interesse na zona de margem. Ative o modo de seleção de ROI na zona de margem do polo animal para definir a área com o melhor espectro.

Clique em mira de ROI na janela de exibição e ajuste o tamanho do ROI de referência para 40 voxels na área de medições. Abra o arquivo recém-gerado contendo os dois canais separados. Produzir uma imagem de projeção bidimensional a partir da série de imagens tridimensionais usando a projeção de máxima intensidade.

Na janela de Processo, selecione o corte para separar canais em dois arquivos separados, o canal um e o canal dois. Na janela de Processo, selecione Combinar Imagens, depois selecione o arquivo do canal dois e insira-o na primeira opção. Depois, selecione o arquivo do canal um e insira-o na segunda opção.

Defina uma reescala com um fator cinco e escolha a operação de razão. Clique em Aplicar para gerar o novo arquivo contendo a imagem da métrica de razão. Salve o arquivo para análise de dados.

Importar os arquivos de imagem espectral e separação de corantes para o software de código aberto Fiji para análise. Configure parâmetros para medições de leitura em Fiji usando Analisar e Definir Medições. Selecione área, densidade integrada e valor cinza médio como parâmetros de interesse.

Usando a ferramenta de seleção de polígonos na barra de ferramentas, selecione a região de interesse correspondente à margem da gástrula. Sequencialmente, clique em Analisar, Ferramentas e Gerenciador de ROI para salvar as especificações de ROI xy. Para realizar medições em um ROI selecionado, clique em Analisar e Medir.

Organize os FRET por valores de razão CFP para cada ROI em uma planilha com grupos experimentais em colunas e valores brutos em linhas. Para uma única réplica biológica, crie uma tabela de colunas com uma variável de agrupamento, onde cada grupo é definido por uma coluna. Ao final da gastrulação, fixe os embriões por imersão em paradeído a 4% preparado em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente.

Após a fixação, lave os embriões várias vezes com PBS. Usando uma pipeta pastor, oriente os embriões lateralmente em um único poço de uma placa de 12 poços contendo PBS fresco. Usando um microscópio estereoscópico com objetivo de ampliação de 2,7x, objetivo de varredura de 0,63x e fator de zoom de 8,6, capture as imagens em modo campo claro para avaliar a presença de um formato oval.

Importe a imagem do embrião capturada para o software de Fiji. Para medir o comprimento dos eixos do embrião, selecione a ferramenta reta na barra de ferramentas e clique em Analisar, seguido de Medir. Após realizar as medições selecionadas, adicione-as à lista do gerenciador de ROI e salve o arquivo de ROI.

Exporte os dados para uma planilha de exercícios. Calcule a razão dos eixos dividindo o comprimento do eixo maior pelo comprimento do eixo menor. Calcule a média, o desvio padrão da média ou o erro padrão da média de diferentes réplicas.

Nosso pipeline de FRET vivo em peixe-zebra permite a detecção sensível e precoce da ativação patogênica da sinalização ERK, suporte à interpretação de variantes e testes de eficiência de inibidores MEK.