Ensaio de número mais provável modificado para quantificar Salmonella em produtos de frango crus e prontos para cozinhar

Nossa pesquisa desenvolve tecnologias rápidas de detecção, quantificação e caracterização de patógenos transmitidos por alimentos, com foco em métodos sensíveis que podem melhorar a segurança alimentar por meio da identificação de uma contaminação em ambientes do mundo real. Os principais desafios incluem a obtenção de detecção rápida de sensíveis e matrizes complexas com soluções de baixo custo, mas escaláveis. Também abordamos as dificuldades na redução de falsos positivos e na melhoria da compatibilidade com diversos ambientes de teste.

Para a segurança alimentar, isso significa detectar com precisão patógenos em baixas concentrações em uma variedade de matrizes alimentares. Nosso protocolo aborda a lacuna entre a detecção de prevalência e a quantificação de salmonela para fornecer valores determinísticos para o nível de contaminação em produtos alimentícios. O processo é minimamente perturbador, pois incorpora ensaios validados usados nos protocolos FSIS e flexível o suficiente para acomodar patógenos adicionais e matrizes alimentares.

Para começar, coloque o frango moído adquirido do departamento de carnes frescas dos varejistas locais em uma plataforma de trabalho. Divida assepticamente a carne em amostras de 25 gramas. Adquira produtos de frango prontos para cozinhar na seção de alimentos congelados dos varejistas locais e divida-os assepticamente em amostras de 25 gramas.

Streak salmonella enterica sorovar Typhimurium ATCC 14028 em uma placa helicoidal de infusão de coração cerebral. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, inocule 25 mililitros de caldo de infusão cérebro-coração com uma colônia de salmonela recém-cultivada.

Cultive a cultura aeróbica durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 100 RPM. Para preparar uma série de diluição de dez vezes, transfira 0,5 mililitros de cultura para 4,5 mililitros de água peptídica tamponada ou BPW e misture bem. Em seguida, transfira 0,5 mililitros da diluição preparada para 4,5 mililitros de BPW para cada diluição subsequente.

Em seguida, transfira assepticamente 25 gramas de frango moído irradiado para sacos estéreis. Inocular a amostra com um mililitro da concentração desejada da diluição da cultura. Usando um espalhador de células estéreis, distribua suavemente o inóculo uniformemente sobre a superfície do frango e deixe-o repousar a quatro graus Celsius por uma hora.

Depois de incubar amostras de frango moído irradiadas com cultura de salmonela por uma hora, adicione 225 mililitros de BPW a cada amostra para obter a proporção desejada de amostra para meio. Homogeneizar as amostras de frango usando o stomacher em velocidade normal por 120 segundos. Usando uma pipeta de 50 mililitros, remova cuidadosamente o líquido do lado filtrado do estômago e divida-o em dois frascos de centrífuga estéreis.

Centrifugar as amostras a 10 000 g durante 10 minutos e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em três mililitros de BPW usando uma espátula estéril. Adicione 12 mililitros de BPW ao pellet ressuspenso e misture bem mexendo com uma espátula estéril.

Combine o conteúdo de ambas as garrafas de centrífuga em uma garrafa. Adicione três mililitros da amostra ressuspensa a cada poço na coluna um do bloco de 48 poços para criar oito réplicas. Para preparar uma série de diluições de dez vezes nas colunas de um a seis usando uma pipeta de oito canais, adicione 0,3 mililitros da amostra de cada poço em 2,7 mililitros de BPW na próxima coluna, garantindo uma mistura completa.

Incube blocos durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 100 RPM. No dia seguinte, usando uma pipeta multicanal, coloque sete microlitros de cultura de cada diluição em placas de infusão cérebro-coração em uma grade de quatro por seis. Deixe as placas secarem por 10 minutos antes de incubá-las a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas.

Após a incubação, examine as placas helicoidais, marcando pelo menos uma colônia como positiva e nenhum crescimento como negativo. Insira o número de diluição e o fator de diluição em uma planilha. Insira o volume ou peso apropriado da amostra.

Em seguida, especifique o número de réplicas e insira o número de amostras que testaram positivo. Clique em calcular resultados para analisar resultados positivos e negativos anotados usando o método simples de resolução de probabilidade máxima. Para começar, configure o bloco MPN de 48 poços para cultura de salmonela inoculada com amostras de frango.

Misture culturas em um bloco de 48 poços pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transfira 200 microlitros de cada cultura para uma placa de PCR de 96 poços. Selar a placa e centrifugar a 6 600 g durante 10 minutos.

Remova o sobrenadante e adicione 20 microlitros do reagente do kit de extração de DNA ao pellet. Misture o pellet pipetando para cima e para baixo. Novamente, feche a placa e aqueça-a a 99 graus Celsius por 10 minutos, seguida de resfriamento a 20 graus Celsius.

Após a centrifugação, use dois microlitros do sobrenadante para preparar a mistura de QPCR de acordo com o protocolo estabelecido. Usando as seguintes condições, execute a PCR em tempo real. Após a PCR, exporte os resultados e considere os poços com valores de limite de ciclo menores ou iguais a 30 como positivos e maiores que 30 como negativos.

Misture culturas em um bloco de 48 poços pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transfira 20 microlitros de cada amostra para o kit de salmonela de ensaio de detecção molecular fornecido com tubo de lise. Aqueça as amostras a 100 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, incube as amostras por 10 minutos em temperatura ambiente. Transfira 20 microlitros de lisado de cada tubo de lise para um tubo de reagente e carregue os tubos de reagente no suporte. Adicione o suporte com tubos de reagentes ao instrumento do sistema de detecção molecular.

Defina as configurações de software para o ensaio do sistema de detecção molecular. Execute o ensaio e exporte o relatório para análise. O relatório MDS Run fornece informações de saída detalhadas, que são positivas ou negativas.