Cultivo e colheita monoclonal microbiana automatizada e de alto rendimento usando o sistema ômico de cultura de gotículas de microlitro de célula única

Esta pesquisa explora a ômica de cultura microbiana, usando uma plataforma automática, para melhorar o isolamento microbiano, o cultivo e a triagem monoclonal. O objetivo é melhorar a compreensão do intestino humano, do microbioma e de suas aplicações. Os tecnólogos que avançam na pesquisa de microbioma incluem queda de microfluídica, isolamento automático de cepas e plataformas de triagem, algoritmos de aprendizado de máquina e dispensadores monoclonais para ômica de cultura de alta tensão e análise de microbioma.

O sistema de células intermediárias melhora significativamente a microvisão, o isolamento monoclonal e a coloração, gerando quase o dobro do número de clones em comparação com os métodos tradicionais, avançando assim a capacidade de pesquisa na mistura de culturas de microvisualização intestinal. Este protocolo atende à necessidade de uma plataforma de triagem microbiana de baixo custo e alto suporte, superando as limitações dos métodos tradicionais em eficiência e capacidade de pontuação para pesquisa de mistura de culturas. Nosso laboratório se concentrará ainda mais na integração de técnicas adicionais de manipulação de gotículas, como divisão e fusão de gotículas para expandir o escopo das aplicações tecnológicas.

Para começar, abra a porta da câmara de geração e cultivo de gotículas da célula MISS. Remova verticalmente a tampa protetora do micro-tubo e do chip microfluídico de geração de gotículas. Usando uma seringa descartável, adicione 10 mililitros de água destilada estéril ao umidificador dentro da câmara e reinstale a tampa protetora.

Abra a embalagem estéril do microtubo e do chip microfluídico de geração de gotículas e coloque-o verticalmente diretamente acima da câmara de cultivo. Em seguida, na interface do software, clique em instalação. Quando a janela pop-up de confirmação for exibida, clique em sim para iniciar a instalação.

Retire o removedor de bolhas de ar e fixe-o de cabeça para baixo na colocação do removedor de bolhas de ar na câmara. Conecte o tubo de saída de gotículas do removedor de bolhas de ar à válvula de fixação abaixo dele. Guie-o por todo o caminho até a câmara de detecção e coleta de gotículas.

Depois de abrir a porta da câmara, insira verticalmente o tubo de detecção no soquete de detecção. Certifique-se de que o tubo de detecção esteja totalmente inserido. Aperte o parafuso que prende o tubo de detecção no sentido horário.

Depois de confirmar a inserção e a fixação completas, feche a porta da câmara. Conecte cada um dos 10 tubos de silicone do chip microfluídico, rotulados de L1 a L10, às suas válvulas de fixação numeradas correspondentes. Em seguida, conecte o conector rápido do chip microfluídico à porta correspondente no sistema ômico, seguindo as conexões adequadas.

Quando a instalação do chip estiver concluída, uma janela pop-up aparecerá com a mensagem, válvula de fixação da tubulação de gotículas é aberta. Clique em OK quando a instalação do chip de geração de microtubos e gotículas estiver concluída. Depois de garantir que todos os tubos estejam conectados corretamente às válvulas de fixação correspondentes, clique em OK.

Antes de executar a inicialização, clique na interface de configuração para configurar os parâmetros relevantes, como modo seletivo, temperatura de incubação, tempo de incubação, velocidade do agitador, comprimento de onda de detecção de OD e comprimento de onda de excitação e emissão para detecção de fluorescência. Navegue até a interface inicial e clique em inicializar. A janela pop-up de confirmação aparece clique em sim para permitir que o sistema IC execute uma autoverificação de seus componentes, incluindo a bomba injetora, configurações de temperatura, teste de descarga de líquido residual, módulo de triagem e módulo de detecção de gotículas.

Após a conclusão da inicialização, clique em OK na janela pop-up. Para preparar a amostra, pegue a amostra microbiana e faça uma diluição seriada com o meio correspondente para atingir uma concentração de cerca de 50 células por mililitro para obter uma suspensão de amostra de 40 mililitros. Em seguida, desaperte a tampa do frasco de amostra e despeje a suspensão fecal diluída no frasco com uma barra de agitação magnética, até a posição de adição de amostra.

Aperte a tampa e aperte-a firmemente. Em seguida, insira o conector rápido A no conector rápido B para concluir o processo de carregamento da amostra. Depois de colocar o frasco de amostra na posição designada, separe os conectores rápidos A e B do frasco de amostra.

Conecte o conector rápido A do sample frasco à porta O3 no sistema ômico. Conecte o conector C3 no chip microfluídico ao conector rápido B e feche a porta da câmara. Na interface inicial do software, selecione o número desejado de tubos de gotículas a serem gerados e clique em produzir para iniciar a geração de gotículas de célula única.

Aguarde a janela pop-up indicando a conclusão da criação do droplet e clique em OK. Feche o clamp nos três conectores e remova o sample frasco. Na interface inicial do software, selecione o mesmo número de tubo de gotículas usado durante a geração de gotículas.

Cultura de cliques. Confirme o tempo e a temperatura de cultivo e inicie o processo. Aguarde a janela pop-up, indicando a conclusão do cultivo de gotículas.

Pressione o botão UV no sistema ômico para ligar a luz ultravioleta UV. Irradie a câmara de detecção e coleta de gotículas por 30 minutos antes de desligá-la. Em uma bancada super limpa, abra todas as placas de 96 poços usadas para coleta de gotículas e empilhe-as umas sobre as outras sem tampas, numerando-as sequencialmente de baixo para cima.

Certifique-se de que a placa do poço superior esteja coberta com uma tampa. Abra a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas e coloque as placas de poço nas posições designadas. Remova a tampa da placa do poço superior e feche a porta da câmara.

Ligue a luz ultravioleta no sistema ômico novamente por 30 minutos para realizar a esterilização secundária. Em seguida, remova o removedor de bolhas de ar de sua posição de colocação. Desaperte a tampa e remova o parafuso em forma de borboleta da tampa.

Despeje 200 mililitros de óleo de remoção de bolhas de ar no removedor de bolhas de ar. Prenda bem a tampa e, em seguida, fixe o removedor de bolhas de ar de cabeça para baixo em seu local designado. Na interface inicial, selecione o tubo de gotículas para classificação.

Clique em classificação. Insira o número de placas de poço a serem coletadas e inicie o processo de classificação. Observe a área de exibição do processo para medições em tempo real da densidade óptica de gotículas ou valores de fluorescência.

Analise aproximadamente 20 a 30 gotículas para verificar o valor do OD. Se a maioria das gotículas tiver um OD de cerca de 0,2, defina o limite inferior de OD para 0,5 e o limite superior de OD para quatro. O sistema coletará automaticamente gotículas dentro dessa faixa nas placas de 96 poços.

Aguarde a janela pop-up indicando a conclusão da classificação e coleta de gotículas e clique em OK. Abra a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas. Coloque a tampa da placa do poço na placa superior do poço e remova as placas juntas.

Clique em exportar dados para salvar os dados de sinal de gotículas coletados. Clique em mapa de calor. Selecione o arquivo de dados de coleta de gotículas e observe o OD exibido no formato de microplaca.

Visualize esses valores de OD como um mapa de calor em que a intensidade da cor corresponde à distribuição de OD nos poços, fornecendo uma representação clara e intuitiva. A diversidade de espécies da microbiota intestinal humana obtida do sistema ômico, do método da placa sólida e da amostra inicial de fezes foi comparada em nível de família. 34 famílias microbianas foram enriquecidas pelo método da placa sólida e pelo método ômico demonstrado, com o sistema ômico enriquecendo adicionalmente quatro famílias.

O sistema ômico também enriqueceu efetivamente algumas das famílias de baixa abundância. No nível de gênero, ambos os métodos enriqueceram 74 gêneros microbianos, enquanto o método de células MISS enriqueceu adicionalmente 13 gêneros. Além disso, dois gêneros inicialmente presentes em baixa abundância foram efetivamente enriquecidos, utilizando o sistema OMIC.

Esses resultados mostraram que o método de cultura de células MISS proporcionou melhores condições de crescimento para aquelas cepas que estavam presentes em baixas proporções ou tinham baixo desempenho de crescimento na suspensão microbiana original.