Tela CRISPR em todo o genoma para revelar genes radiossensíveis e radiorresistentes

Esta pesquisa se concentra na triagem CRISPR em todo o genoma e na radioterapia. Fornecemos um protocolo para visualizar genes radiossensíveis e radiorresistentes usando uma tela CRISPR de todo o genoma em células de câncer de pulmão após a irradiação. Os desafios experimentais atuais incluem os efeitos fora do alvo, causados pela vasta complexidade do genoma e possíveis dificuldades em explorar os mecanismos subjacentes. Comparado com os métodos tradicionais de triagem, o CRISPR alcança modificação genética permanente e mostra precisão superior, o que o torna especialmente valioso na pesquisa genômica funcional e na descoberta de alvos. No futuro, nossa equipe se concentrará em estudar a tela CRISPR in vivo para resolver os problemas que esta pesquisa deixou para trás, e estaremos comprometidos em otimizar a tecnologia CRISPR.

[Narrador] Para começar, ajuste a densidade celular aderente para cinco vezes 10 elevado a cinco células por mililitro. Usando uma pipeta, distribua dois mililitros da suspensão celular em cada placa de cultura de 3,5 centímetros para tratamento de radiação em diferentes doses. Coloque os pratos em uma incubadora ajustada para 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e incube durante a noite. Numere cada placa de cultura de 3,5 centímetros de um a cinco, usando um marcador. Usando uma fonte de radiação, administre doses de radiação de 2, 4, 6 e 8 gray, respectivamente, aos pratos de dois a cinco. Ajuste a densidade celular irradiada para uma vez 10 elevado a cinco células por mililitro. Semear 10 microlitros por poço, correspondendo a 1000 células por 100 microlitros em placas de seis poços com três repetições por dose de radiação. Em seguida, semeie 30 microlitros por poço, correspondendo a 3000 células por 100 microlitros em placas de 96 poços com cinco repetições por dose de radiação. Agora, misture o reagente CCK-8 com o meio RPMI 1640 sem FBS na proporção de um para nove. Adicione a mistura à placa de 96 poços e incube a placa no escuro por uma hora. Em seguida, use um leitor de microplacas para medir a densidade óptica em 450 nanômetros. Para iniciar o processo de infecção, estabeleça um gradiente de concentração logarítmica para lentivírus de zero a 800 unidades por mililitro. Adicione o volume correspondente de lentivírus a dois microlitros de polibreno por prato e deixe equilibrar em temperatura ambiente por cinco minutos. Goteje lentamente a mistura de lentivírus polibreno em cada poço. Ajuste a densidade celular parental para três vezes 10 elevado a cinco células por mililitro e inocule um mililitro em cada poço de uma placa de 12 poços. Adicione puromicina em um gradiente de concentração aos poços. Após 72 horas de infecção, substitua o meio em cada poço por meio completo contendo a concentração mínima de puromicina para matar as células. Calcule a multiplicidade de infecção para cada poço com base nas células sobreviventes. Ajuste a densidade celular aderente para um vezes 10 elevado a sete células por mililitro. Adicione lentivírus a uma multiplicidade de infecção igual a 0,3 em 30 microlitros por prato de polibreno e deixe-o equilibrar em temperatura ambiente por cinco minutos. Goteje lentamente a mistura de lentivírus e polibreno na placa de cultura de 15 centímetros. Misture bem e incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No segundo dia após a infecção, aspire o meio da placa de cultura e substitua-o por 15 mililitros de meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Repita o mesmo tratamento para as células parentais não infectadas como controle negativo e continue cultivando por 72 horas. Agora, digerir as células de uma placa de cultura de 15 centímetros usando 0,25% de tripsina. Ressuspenda as células em meio completo RPMI 1640 com 10% de PBS e conte o número de células. Depois de extrair o DNA genômico para o dia zero, use um espectrofotômetro UV NanoDrop para medir a concentração e a pureza do DNA. Administrar uma dose adequada de radiação às células do grupo de tratamento e deixar as células do grupo de controlo não tratadas para se propagarem normalmente. Após 14 dias de tratamento, digerir as células do grupo de tratamento e controle usando tripsina a 0,25%. Ressuspenda as células em meio completo RPMI 1640 com 10% de FBS. Centrifugar as células a 300 G durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS. Depois de repetir a etapa de centrifugação, extraia o DNA genômico do dia 14 do pellet e determine a concentração de DNA. Em seguida, prepare os primers necessários e dilua-os para 10 micromolares. Depois de adicionar os componentes para configurar um sistema de reação de 20 microlitros, centrifugue o tubo brevemente a 300 G por cinco segundos. Para eletroforese em gel de agarose, prepare o gel, remova o pente e encha o tanque de eletroforese com tampão suficiente para cobrir o gel. Adicione o tampão de carregamento à amostra de DNA e misture bem. Finalmente, carregue a mistura nos poços e inicie a eletroforese A formação de colônias após 14 dias revelou que a exposição a dois Gray de radiação reduziu significativamente o número de colônias sobreviventes em comparação com zero Gray. O ensaio CCKA mostrou um declínio substancial na viabilidade celular em dois Gray, com decréscimo adicional em doses de radiação mais altas. O tratamento com concentrações crescentes de puromicina por 72 horas mostrou que um micromolar era a concentração mínima necessária para eliminar as células A549. A validação por PCR mostrou bandas distintas em 231 pares de bases, confirmando o comprimento esperado das sequências de sgRNA na biblioteca CRISPR. A análise de sequenciamento revelou que aproximadamente 60% das leituras foram mapeadas com sucesso para o genoma de referência. As contagens de leitura de sgRNA seguiram uma distribuição de Poisson, correspondendo às expectativas teóricas para uma triagem em escala de genoma. A análise de PCA e mapa de calor mostrou alta variabilidade intergrupos e baixa variação intergrupos, validando a consistência experimental. A análise de ontologia genética identificou a resposta a danos no DNA como uma via enriquecida entre os 15 principais resultados.