Um procedimento de cirurgia Craniotomia para Brain Imaging crônica

As técnicas de imagem estão se tornando cada vez mais importantes no estudo da função cerebral. Entre eles, a microscopia a laser de dois fótons surgiu como um método extremamente útil, pois permite o estudo do cérebro da anta viva e com preparações adequadas. Esta técnica permite a observação da mesma área cortical cronicamente de minutos a meses.

Neste vídeo, mostramos uma preparação para imagens crônicas in vivo do cérebro usando duas microscopias fotográficas. O Dr. Carl Voda, um investigador do Howard Hughes Medical Institute na Janelia Farm, foi inicialmente pioneiro na preparação da janela craniana Isso vamos demonstrar hoje. Oi E Ricardo deve do laboratório de Carlos Porter Cayo no Departamento de Neurologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles.

Hoje vamos mostrar o procedimento para criar uma janela craniana para imagens crônicas in vivo. Esta preparação é muito útil porque permite obter imagens profundas do cérebro usando um microscópio a laser de fótons. Então, vamos começar.

Antes de iniciar a cirurgia, os camundongos são anestesiados com flúor. 4% para indução, um ponto meio a 2% para cirurgia, usando procedimentos aprovados pela I-A-C-U-C, é importante usar pinças de cauda e/ou dedo do pé para garantir que o animal esteja totalmente sedado. Usando um aparador de roedores, o cabelo da nuca até os olhos é raspado.

Após o barbear, o mouse é colocado em uma estrutura estereotáxica, apoiada em um cobertor de recirculação de água A 37 graus Celsius, a cabeça é firmemente presa por meio de barras auriculares. A pomada para os olhos é então aplicada para evitar que o olho do animal seque. Em seguida, dexametasona, 0,2 miligramas por quilograma e carprofeno cinco miligramas por quilograma são administrados por via subcutânea.

A fim de prevenir o inchaço do cérebro e/ou uma resposta inflamatória, respectivamente. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de esterilizar a área cirúrgica limpando a pele com três cotonetes alternados de álcool 70% e Betadine. Todos os instrumentos cirúrgicos foram pré-esterilizados usando um esterilizador de esferas de vidro usando tesouras que foram pulverizadas com etanol.

A pele sobre o topo do crânio é removida, começando com um corte horizontal ao longo da base da cabeça, seguido por dois cortes no sentido rostral, quase atingindo as pálpebras. Em seguida, dois cortes oblíquos que convergem na linha média. Neste ponto, uma gota de solução de lidocaína e epinefrina é aplicada no periósteo para evitar sangramento excessivo ou dor com um bisturi, o periósteo é retraído para as bordas do crânio.

A musculatura da nuca também é levemente retraída. Toda a área exposta do crânio é então raspada suavemente com um bisturi para criar uma superfície seca. Isso é muito importante porque permitirá que a cola adira melhor quando for aplicada posteriormente.

Uma vez escolhido um local de imagem, você está pronto para criar a janela craniana primeiro. Um círculo de cerca de quatro milímetros de diâmetro é desenhado suavemente com uma broca odontológica pneumática. Após uma leve perfuração, a solução de epinefrina de lidocaína é aplicada novamente na superfície do crânio.

A perfuração é interrompida quando uma camada muito fina de osso é deixada, geralmente um nariz. Este estágio é alcançado empurrando suavemente o centro de sua craniotomia para sentir como ela cede sob uma gota de solução salina e aproveitando a trabécula óssea. Uma estrutura esponjosa do osso.

A craniotomia é levantada do crânio com uma pinça de ponta muito fina. A solução salina é importante porque ajudará a levantar o crânio e evitar o sangramento da dura-máter. Em seguida, a espuma de gel previamente embebida em solução salina é aplicada à dura-máter para interromper qualquer pequeno sangramento que às vezes ocorra quando o crânio é removido.

Depois de secar a superfície da dura-máter e garantir que não haja sangramento, uma lamínula de vidro estéril de cinco milímetros é colocada suavemente sobre a dura-máter. Uma gota de cola à base de cianoacrilato é aplicada no hemisfério oposto do crânio. Com a ajuda de uma agulha, a cola é aplicada suavemente ao redor da janela com cuidado para não colocá-la sob o vidro.

A cola agora pode ser aplicada em uma camada fina em toda a superfície do crânio. Depois que a cola seca, o acrílico dental é misturado e aplicado em toda a superfície do crânio, cobrindo também uma pequena borda da lamínula para prendê-la. Depois de prender a lamínula, um pequeno poço é feito ao redor da janela com acrílico dental.

Uma barra de titânio também está embutida no acrílico dental. Esta barra será usada posteriormente para prender o mouse com segurança na platina do microscópio. Para imagens, é importante garantir que a barra esteja nivelada de modo que fique paralela a uma janela craniana.

Colocar um pedaço de papel sob a barra pode permitir que a barra permaneça nivelada enquanto o acrílico endurece, o acrílico dental pode curar ou endurecer por 10 minutos, momento em que a barra de titânio foi fixada no lugar. O animal é então colocado em uma gaiola quente até que se recupere. Após a recuperação da anestesia, O animal pode ser fotografado no mesmo dia.

Este filme mostra uma pilha de 160 imagens tiradas em intervalos de cinco mícrons com nosso microscópio personalizado de dois fótons através de uma janela craniana colocada sobre o córtex somatossensorial de um camundongo GFPM de três meses de idade. Esta linha transgênica de camundongos expressa GFP em um pequeno subconjunto de neurônios parmal. Na camada cinco e na camada dois três, a imagem foi tirada com uma objetiva de imersão em água de 40 x com abertura numérica de 0,8 usando um comprimento de onda de excitação de 910 nanômetros.

Nas imagens mais superficiais, é fácil reconhecer os mandris dendríticos dos dendritos apicais das células parametálicas. O tufo apical dos dendritos de cada neurônio converge para um único grande dendrito apical. Dendritos oblíquos menores também podem ser vistos saindo deste principal dendrito apical, axônios cruzando o campo de visão também são evidentes.

Esta é uma pilha de 12 imagens tirando cada um mícron e meio usando a mesma objetiva de 40 x em maior ampliação, um dendrito superficial é mostrado em alta resolução o suficiente para resolver espinhas dendríticas individuais. Acabamos de mostrar como realizar uma preparação de janela craniana para imagens crônicas do cérebro usando a microscopia fotográfica. Este é um método extremamente poderoso para o estudo do cérebro, pois permite estudar tanto a estrutura quanto a função do cérebro vivo, não apenas em uma única imaginação, mas também cronicamente por meio de múltiplas imaginações ao longo de períodos de meses.

Outra vantagem da preparação da janela craniana é que um grande preenchimento de visão pode ser visualizado, o que possibilita a imagem de grandes estruturas, como uma ação inteira ou o mandril inri em intervalos de milímetros. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de trabalhar nas condições mais limpas e estéreis possíveis e ter uma mão muito firme. Ok, e é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.