Name: Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de troca lipídica em células vivas usando ciclodextrina para estudar dinâmica de membranas e sinalização de receptores tirosina quinase. Este método permite investigar a localização e ativação de receptores em ambientes nativos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%2C+detergent-resistant+membranes%2C+and+raft+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.</a> Physiology. 21, 430-439 (2006).</li>
<li>Schroeder, R., London, E., Brown, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+saturated+acyl+chains+confer+detergent+resistance+on+lipids+and+glycosylphosphatidylinositol+%28GPI%29-anchored+proteins%3A+GPI-anchored+proteins+in+liposomes+and+cells+show+similar+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).</li>
<li>Suresh, P., Miller, W. T., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+exchange+shows+insulin+receptor+activity+is+supported+by+both+the+propensity+to+form+wide+bilayers+and+ordered+raft+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).</li>
<li>Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+structure+dependence+of+insulin+receptor+and+insulin-like+growth+factor+1+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).</li>
<li>Zidovetzki, R., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cyclodextrins+to+manipulate+plasma+membrane+cholesterol+content%3A+evidence%2C+misconceptions+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).</li>
<li>Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B1-%2C+%CE%B2-+and+%CE%B3-cyclodextrins+on+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes.</a> Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cyclodextrin-induced+lipid+substitution+to+study+membrane+lipid+and+ordered+membrane+domain+%28raft%29+function+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+replacement+of+plasma+membrane+outer+leaflet+phospholipids+and+sphingolipids+in+cells+with+exogenous+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).</li>
<li>Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+replacements+within+the+tetrabasic+cleavage+site+on+the+processing+of+the+human+insulin+receptor+precursor+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid+structure+and+raft+domains+in+living+cells+with+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).</li>
<li>Klymchenko, S., Kreder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells.</a> Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+receptors%2C+lipid+rafts+and+caveolae%3A+An+evolving+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+ActaMol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story.</a> Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+detergent-resistant+membrane+domains%3A+does+phase+separation+occur+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).</li>
<li>Lin, Q., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+plasma+membrane+mimicking+vesicles+with+lipid+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry.</a> PLoS One. 9 (1), e87903(2014).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipid+flippases+can+modulate+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">How lipid flippases can modulate membrane structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).</li>
<li>Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+externalization+of+phosphatidylserine+at+the+cell+surface%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacing+plasma+membrane+outer+leaflet+lipids+with+exogenous+lipid+without+damaging+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity.</a> PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).</li>
<li>Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transbilayer+%28flip-flop%29+lipid+motion+and+lipid+scrambling+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes.</a> FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%CE%B1CD-based+plasma+membrane+outer+leaflet+lipid+exchange+in+mammalian+cells+to+study+insulin+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Approach+Study+Memb+Struct+A+Exp%22%5BJournal%5D)">MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity.</a> Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dilaurol-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>850355</tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Anti-receptor de insulina &beta; anticorpo</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>CST3025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pYpY1162/1163 Anticorpo anti-receptor de insulina</td><td>R & D Systems Inc.</td><td>AF2507</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho, tecnologia de sinalização celular de anticorpos ligados a HRP</td><td>7074</td><td></td>Tubos <td>de</td></tr><tr><td>ensaio de vidro borossilicato (12 x 75 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielina cerebral (bSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860062</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielina de ovo (eSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino ( FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>G418 sal dissulfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Solução antibiótico-antimicótica (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s meio de águia modificado (DMEM, 4,5 g/L de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>presunto Gibco' s F12 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Gibco fosfato tamponado solução salina (PBS) sem cálcio e magnésio (0,144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0,795 g/L Na2- HPO4 (anidro))Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia em camada fina de alta eficiência (HP-TLC)</td><td>Merck</td><td>HP-TLC Silica Gel 60 placas</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Metotrexato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>454126</td><td></td></tr><tr><td>Metil-&alfa;- ciclodextrina (M&alfa; CD)</td> <td>AraChem</td><td>CDexA076 / BR</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio,</td><td>Sigma ativado Aldrich</td><td>5.08605</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de troca lipídica em células vivas

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Para demonstrar a mudança observável na composição lipídica celular após a troca, realizamos HP-TLC em células CHO IR após a troca de SM cerebral (bSM) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (Figura 1). Nos casos em que esfingomielinas como bSM estão sendo usadas para troca, um aumento na intensidade da banda SM é aparente, juntamente com uma diminuição na intensidade da banda PC em relação ao controle não tratado. Por outro lado, ao trocar fosfatidilcolinas como DOPC, a banda PC se ...

Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Os proteolipossomas são usados para estudar canais purificados e transportadores reconstituídos em um ambiente bioquímico bem definido. Um procedimento experimental para medir o efluxo mediado por essas proteínas é ilustrado. As etapas para preparar proteolipossomas, realizar os registros e analisar os dados para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da proteína reconstituída são descritas.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Descrevemos aqui um ensaio livre celular bioquímico fluorométrica para determinação da peroxidação lipídica-HDL. Este ensaio rápido e reprodutível pode ser usado para determinar a função do HDL em estudos de grande escala e pode contribuir para nossa compreensão da função do HDL em doenças humanas.

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Este protocolo fornece uma abordagem eficiente para medir a absorção de colesterol LDL com taxas de fluxo em tempo real usando uma célula viva, sistema em vários tipos de células de imagem. Esta técnica fornece uma plataforma para a atividade farmacológica de compostos afetando o influxo de LDL enquanto monitora para morfologia celular e citotoxicidade, portanto, potencial de tela.

Ensaio de absorção de LDL colesterol usando célula viva análise com célula de imagem monitoramento de integridade

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Apresentamos um método para a aquisição de cursos de tempo de repórter fluorescência de células únicas usando matrizes micropatteradas. O protocolo descreve a preparação de matrizes unicelulares, a configuração e o funcionamento de microscopia de lapso de tempo de varredura de células vivas e uma ferramenta de análise de imagem de código aberto para pré-seleção automatizada, controle visual e rastreamento de cursos de tempo de fluorescência integrados por células por local de adesão.

Imagem de células vivas de matrizes unicelulares (LISCA) - uma técnica versátil para quantificar cinética celular

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

A lipofagia é uma forma seletiva de autofagia que envolve a degradação de gotículas lipídicas. Disfunções nesse processo estão associadas ao desenvolvimento do câncer. No entanto, os mecanismos precisos ainda não são totalmente compreendidos. Este protocolo descreve abordagens quantitativas de imagem para entender melhor a interação entre autofagia, metabolismo lipídico e progressão do câncer.

Explorando a regulação do catabolismo de gotículas lipídicas por meio da lipofagia

Aqui, descrevemos os protocolos para medir a quantidade de fosfolipídio fluorescente especificamente removido das partículas doadoras de lipídios pela lipoproteína de alta densidade (HDL) presente no plasma ou soro humano total. Mostramos que essa métrica de funcionalidade HDL prevê doenças cardiovasculares incidentes.

Ensaio de efluxo de fosfolipídios específico para lipoproteína de alta densidade

Aprenda a realizar ensaios de troca lipídica em células vivas usando ciclodextrina para estudar dinâmica de membranas e sinalização de receptores tirosina quinase. Este método permite investigar a localização e ativação de receptores em ambientes nativos.

Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Explorar mais vídeos