Estudando interações entre células mieloides e células T CAR in vitro e in vivo

Nosso estudo fornece modelos in vitro e in vivo simplificados para entender o impacto dos macrófagos imunossupressores humanos na atividade antitumoral do CA 19 no contexto do linfoma de células do manto. O modelo mais comumente usado para estudar os macrófagos e monócitos humanos in vivo é enxertar células-tronco hematopoiéticas em camundongos imunodeficientes erradicados. O enxerto de camundongos imunodeficientes com células-tronco hematopoiéticas humanas para estudar células mieloides humanas em camundongos pode ser demorado e caro.

A eficiência do enxerto também pode ser limitada. Estabelecemos modelos in vitro e in vivo mais simplificados para estudar as interações entre macrófagos humanos, CAR T e células tumorais. Ele também pode ser usado para testar outras imunoterapias direcionadas a macrófagos.

Para começar, centrifugue os 10 milhões de monócitos clássicos humanos isolados a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meios de cultura até uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro. Adicionar GM-CSF recombinante humano à suspensão até atingir uma concentração final de 10 nanogramas por mililitro e homogeneizar.

Transfira os monócitos para um frasco de cultura de tecidos T25 e incube-os a 37 graus Celsius por sete dias. No sétimo dia, pipete as células vigorosamente no gelo a cada 10 minutos, verificando ao microscópio até que a maioria dos macrófagos se desprenda. Transfira as células destacadas para um tubo cônico de 15 mililitros no gelo.

Em seguida, lave as células com PBS gelado para soltar as células restantes e combine-as no tubo cônico. Conte as células usando um contador de células automatizado e centrifugue-as a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante e, em seguida, lave e ressuspenda o pellet com cinco mililitros de PBS gelado.

Depois de centrifugar novamente o tubo e aspirar o sobrenadante, ressuspender o grânulo celular final em PBS gelado para atingir uma concentração de 20 milhões de células por mililitro. Transfira a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e mantenha-o no gelo. Em seguida, transfira as 15 milhões de células JeKo positivas para luciferase preparadas para um tubo cônico de 15 mililitros.

Depois de centrifugar as células JeKo, aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em PBS gelado a uma concentração de 40 milhões de células por mililitro. Agora, misture os mesmos volumes da suspensão de macrófagos e da suspensão de células tumorais em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Adicione o mesmo volume de matriz de membrana basal solubilizada e misture bem com gelo. Como controle, misture as células JeKo restantes com o mesmo volume de PBS em um novo tubo de microcentrífuga. Adicione o mesmo volume de matriz de membrana basal solubilizada e misture com gelo.

Depois de anestesiar os ratos, coloque-os em um palco aquecido com cones nasais. Aplique uma pomada oftálmica em ambos os olhos dos camundongos para evitar danos à córnea. Raspe o flanco direito de cada mouse para expor a pele.

Carregue 100 microlitros da mistura de macrófagos JeKo em uma seringa de 0,5 mililitro e remova as bolhas de ar. Levante suavemente a pele exposta e insira a agulha na área elevada da pele, enquanto aplica pressão do dedo no local. Injete lentamente as células na camada subcutânea e retire suavemente a agulha.

Para avaliar o impacto in vivo de macrófagos imunossupressores, a progressão da carga tumoral foi rastreada por imagens de bioluminescência em camundongos NSG, enxertados com células JeKo isoladamente ou em combinação com macrófagos diferenciados. A presença de macrófagos diferenciados acelerou acentuadamente a progressão do tumor in vivo, conforme indicado por uma carga tumoral significativamente maior em camundongos co-enxertados no dia 17 em comparação com o JeKo sozinho.