Name: Produtos finais de glicação avançada sensibilizam células neuronais sensoriais humanas ao influxo de cálcio induzido por capsaicina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Descubra como produtos finais de glicação avançada sensibilizam neurônios sensoriais humanos à capsaicina via canais TRPV1. Este método revela mecanismos de dor em doenças degenerativas.

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Cultura e diferenciação de 1. SH-SY5Y em células neuronais sensoriais
NOTA 1: Todas as etapas presentes nesta seção precisam ser feitas sob uma capela de fluxo laminar e todas as soluções e suprimentos precisam ser estéreis.
<ol><li>Primeiro, prepare um frasco de cultura (25 cm2) adicionando 5 mL de meio de cultura. NOTA: Para descongelamento, expansão e manutenção deste tipo de célula, use uma mistura de meio de cultura: Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12 (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Em seguida, remova o criotubo contendo as células SH-SY5Y do nitrogênio líquido e mantenha-o no gelo. Descongele as células em banho-maria a 37 °C durante 2 min.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio de cultura completo ao criogenial, transfira as células para um tubo de 15 mL, adicione 3 mL de meio de cultura completo (DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor) e misture extraindo-o repetidamente e dispensando-o de volta ao tubo usando uma pipeta.</li>
	<li>Pipetar as células para o tubo de 15 ml e centrifugar a 290 g. Descarte o sobrenadante para remover o dimetilsulfóxido (DMSO), um agente crioprotetor usado para evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento das células.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio de cultura ao pellet celular, misture bem com uma pipeta e coloque-os em um frasco de cultura25 cm 2 para expandir as células. Colocar as células numa incubadora numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C. NOTA: As células podem ser usadas quando atingem aproximadamente 80% de confluência. Para diferenciação neuronal, recomenda-se o uso de células SH-SY5Y até a passagem celular vinte.</li>
	<li>Prepare a matriz de colágeno extracelular (100 μg / mL) diluindo o colágeno tipo I de cauda de rato em PBS estéril e despeje 1 mL dessa solução em uma placa de Petri (35/10 mm) para revestimento.</li>
	<li>Incube isso em uma incubadora em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 por aproximadamente 1 h.</li>
	<li>Após esse período, lave a placa duas vezes com PBS estéril e, em seguida, conte as células usando a câmara de Neubauer.</li>
	<li>Para contar as células, lave primeiro o balão de cultura2 de 25 cm contendo a célula com 5 ml de PBS estéril para remover todo o meio de cultura. Em seguida, remova o PBS estéril, adicione 3 mL de tripsina a 0,05% às células e coloque-as em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por aproximadamente 3-5 min para completar o descolamento celular.</li>
	<li>Em seguida, retirar as células da incubadora, adicionar 6 ml de meio de cultura ao balão de cultura e transferir esta solução para um tubo de 15 ml. Centrifugue a 290 g por 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda bem as células em 1 mL de meio de cultura completo.</li>
	<li>Finalmente, conte as células usando uma câmara de contagem de Neubauer. Misture 20 μL de células e 20 μL de azul de tripano e adicione 10 μL dessa mistura a uma câmara de Neubauer. Conte as células vivas que não se coram em azul.</li>
	<li>Placa 5 × 10células de 4 células/mL em uma placa de Petri (35/10 mm) no mesmo meio de cultura descrito anteriormente. Use o volume total de 1 mL por placa.</li>
	<li>Em seguida, aguarde 24 h para iniciar o protocolo de diferenciação neuronal. Para isso, retirar o meio de cultura e substituí-lo por 1 mL de DMEM/F12 suplementado com 2% de soro fetal bovino inativado pelo calor, 1% de penicilina-estreptomicina e 10 μM de ácido all-trans retinóico (AR 10 μM).</li>
	<li>Aguarde 48 h e substitua o meio de cultura todos os dias durante 3 dias. Colocar as células numa incubadora numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>No quinto dia, remova o meio das células e adicione 1 mL de meio de cultura sem soro suplementado com fator neurotrófico derivado do cérebro humano (BDNF 50 ng/mL) em cada placa. NOTA: BDNF de diferentes empresas (ver tabela de material) foi testado. Todos eles funcionaram da mesma maneira.</li>
	<li>No sétimo dia de diferenciação, lave as células com PBS estéril uma vez e use células neuronais sensoriais para experimentos. Se for impossível usar essas células imediatamente para experimentos, adicione um meio de cultura sem soro para mantê-las vivas até o uso. NOTA: Ao final da diferenciação neuronal, é necessário lavar as células com PBS estéril para remover o BDNF restante, evitando a toxicidade celular.</li>
</ol>2. Colágeno glicado e processo de glicação
NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser feitas sob uma capela de fluxo laminar e todas as soluções e suprimentos devem ser estéreis.
<ol><li>Prepare a glicação do colágeno incubando o colágeno tipo I do estado fibrilar da cauda do rato (3,89 mg / mL) com 200 mM de D-ribose, 160 mM de D-glicose e 200 mM de D-treose a 4 ° C por 7 dias. NOTA: Para preparar o colágeno glicado, pese os açúcares com base em seu peso molecular e misture-os com colágeno tipo I do estado fibrilar da cauda de rato (3,89 mg / mL).</li>
	<li>Incubar cultura de células de neurônios sensoriais por 24 h com matriz extracelular de colágeno glicado (ECM-GC, 100 μg/mL) ou matriz extracelular de colágeno normal (ECM-NC, 100 μg/mL) preparada em meio de cultura DMEM/F12 sem suplementação de soro e antibiótico.</li>
</ol>3. Ensaio de influxo de cálcio
<ol><li>Para o influxo de cálcio, use o kit de ensaio de fluxo de cálcio e prepare as soluções de acordo com as instruções do fabricante, conforme indicado abaixo.</li>
	<li>Inicialmente, prepare 1 mL de carga de corante Fluo-8 adicionando 2 μL de solução estoque de Fluo-8 em 998 μL de tampão de ensaio 1x (uma mistura de tampão HBSS e 10x Pluronic F127 Plus. NOTA: Esta solução de trabalho é estável por pelo menos 2 h em temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Posteriormente, incubar 250 μL dessa solução em cada placa plaqueada de células neuronais sensoriais previamente diferenciadas e tratadas com ECM-NC ou ECM-GC por 30 min em atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C. Em seguida, retire o prato da incubadora e mantenha-o em RT (no escuro) por 30 min. NOTA: Esta solução torna-se citotóxica se a incubação de 2 h for extrapolada. Prepare a solução de capsaicina durante o período de incubação.</li>
</ol>4. Indução de capsaicina
NOTA: A capsaicina, um agonista do TRPV1, foi usada para induzir o influxo de cálcio nas células.
<ol><li>Pesar e diluir a capsaicina em etanol a 1% e água ultrapura. Em seguida, prepare uma solução na concentração de 2 μM, que também foi diluída em água ultrapura. NOTA: A solução de capsaicina deve ser feita no dia do uso. Diluir a capsaicina primeiro em etanol e depois em água; caso contrário, ele irá precipitar.</li>
	<li>Adicionar 250 μL de solução de capsaicina 2 μM a cada placa de Petri de 35/10 mm, de modo a que a concentração final seja de 1 μM. NOTA: A concentração da solução estoque de capsaicina foi de 2 μM para garantir melhor dispersão e evitar picos de fluorescência isolados.</li>
</ol>5. Imagem de influxo de cálcio e análise de microscopia confocal
NOTA: A imagem foi realizada em um microscópio confocal equipado com uma objetiva de 20x/0,75NA e um laser de excitação de 488 nm (intensidade de 0,5%). A emissão foi detectada a 520 nm. As células foram escaneadas em eixos xy (512 x 512 pixels) ao longo do tempo (t) a uma velocidade de 600 Hz com um intervalo de aquisição de 433 ms e um tempo total de aquisição de 5 min. A imagem foi realizada a 37 °C para manter a condição fisiológica das células usando o software de microscopia.
<ol><li>Prepare uma seringa com 250 μL de solução de capsaicina 2 μM (a concentração final na placa será de 1 μM) e conecte-a a um conjunto de veias do couro cabeludo - Butterfly tipo 23 GA estéril. Prenda a seringa usando um suporte de laboratório e clamp.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri no estágio do microscópio e, com extremo cuidado, coloque a agulha do couro cabeludo na placa de Petri, evitando o contato com o fundo, a ponta da agulha não deve ser submersa no líquido. NOTA: Uma fita adesiva pode ser usada para fixar a posição do couro cabeludo.</li>
	<li>Encontre um campo com um número adequado de células (mais de 20) e ajuste o foco usando luz de campo brilhante.</li>
	<li>Inicie o modo Live com um laser de 488 nm e ajuste os parâmetros de foco e iluminação.</li>
	<li>Inicie o registro da aquisição e, após o período basal (t = 0 a t = 60 segundos), aplique 250 μL de capsaicina 2 μM e empurre suavemente o êmbolo da seringa para estimular o influxo de cálcio nas células. NOTA: O tempo final de aquisição do registro foi de aproximadamente 300 s por placa.</li>
</ol>6. Pós-processamento/análise de dados
<ol><li>Execute a análise celular usando o software de microscopia no modo de quantificação . Primeiro, analise as células de pico de fluorescência antes e depois do estímulo da capsaicina.</li>
	<li>Crie uma região de interesse (ROI) em cada célula responsiva, ou seja, células que exibem um pico de fluorescência após a capsaicina. Certifique-se de desenhar ROI em toda a área da célula, conforme demonstrado acima (Figura 1).</li>
	<li>Exporte os dados em um arquivo CSV (valores separados por vírgula) para análise subsequente.</li>
	<li>Como alternativa, execute a análise usando o software disponível gratuitamente FIJI7 (https://fiji.sc).<ol><li>Para abrir os arquivos de imagem, use o plug-in Bio-Formats navegando até Arquivo &gt; Importar &gt; Bio-Formats e selecionando o arquivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Em seguida, use a ferramenta Lupa para aumentar o zoom e a ferramenta Seleção à mão livre para desenhar uma Região de interesse (ROI) ao redor das células responsivas.</li>
	<li>Depois de desenhar cada ROI, pressione a tecla T para adicioná-lo ao ROI Manager. Repita esse processo para todas as células de interesse (Figura 2).</li>
	<li>Depois que todos os ROIs forem adicionados, vá para a janela Gerenciador de ROI , selecione todos os ROIs e navegue até Analisar &gt; Definir Medidas no menu principal.</li>
	<li>Em seguida, retorne ao ROI Manager e selecione More &gt; Multi Measure para medir a intensidade em todos os quadros. Os resultados aparecerão em uma nova janela; exporte como um arquivo CSV acessando Arquivo &gt; Salvar como. NOTA: O arquivo CSV pode ser analisado no Excel, Google Sheets e software GraphPad. Use a equação ΔF/F0 = (F(t) - F0)/F0 para converter os valores de intensidade de fluorescência obtidos com o kit de ensaio de fluxo de cálcio Fluo-8 em uma medida relativa da mudança do influxo de cálcio. Aqui, F0 representa a fluorescência basal, calculada como a intensidade média das imagens capturadas de t = 0 s a t = 60 s antes da estimulação com capsaicina. F(t) é o valor da intensidade máxima de fluorescência observada após o estímulo, que permite avaliar o pico de influxo de cálcio. Essa abordagem destaca o aumento da fluorescência em relação à linha de base, onde um aumento no ΔF / F0 indica um nível elevado de cálcio intracelular.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig01v2.jpg"> Figura 1: Exemplo de ROI nas células selecionadas para análise de influxo de cálcio no software LAS X. (A) Interface LAS X no modo de quantificação. O retângulo rosa mostra a guia de quantificação. O retângulo amarelo mostra a ferramenta desenhar polilinha e o retângulo ciano mostra as ferramentas de redução e ampliação. (B) Campo de visão (FOV) capturado. (C) Amplie o FOV para facilitar o desenho do ROI em toda a célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5.jpg"> Figura 2: Exemplo de ROI nas células selecionadas para análise de influxo de cálcio no software FIJI. (A) Interface FIJI mostrando o menu principal e a ferramenta. O quadrado vermelho mostra a ferramenta de lupa e o quadrado verde mostra a seleção à mão livre. (B) Campo de visão (FOV) capturado com zoom e um ROI desenhado. (C) A janela do gerenciador de ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
7. Solução de problemas
<ol><li>Se a imagem estiver fora de foco, tente o seguinte:<ol><li>Verifique a aderência da fita; Se afrouxar, isso pode fazer com que a agulha se desloque e afete o foco.</li>
		<li>Recoloque a agulha com fita adicional para maior estabilidade.</li>
		<li>Substituição de agulhas padrão. Use pontas de agulha dentária pré-dobradas para melhorar o alinhamento na placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Se as células estiverem exibindo um sinal saturado, tente as seguintes etapas:<ol><li>Diminua a intensidade do laser e as configurações de ganho.</li>
		<li>Verifique o tempo de incubação do reagente. Se exceder a recomendação do fabricante, pode levar à saturação do sinal, complicando a detecção do influxo de cálcio.</li>
	</ol></li>
	<li>Siga estas sugestões adicionais para solução de problemas:<ol><li>Calibração regular: Certifique-se de que o equipamento de imagem esteja calibrado regularmente para manter o foco e a qualidade da detecção do sinal.</li>
		<li>Alterações de documentos: Mantenha um registro de todos os ajustes feitos no protocolo para referência futura e para facilitar a solução de problemas.</li>
		<li>Ajustes reativos: Se os problemas persistirem, considere testar com diferentes concentrações de reagentes ou métodos alternativos de detecção de sinal.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bierhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+RAGE%2C+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products.</a> J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).</li>
<li>Hudson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+receptor+for+advanced+glycation+endproducts%3A+A+new+target+for+therapeutic+intervention+in+diabetic+complications+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders.</a> Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).</li>
<li>Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycated+collagen+-+a+3D+matrix+system+to+study+pathological+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior.</a> Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).</li>
<li>Bufalo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neuron-like+cells+and+glycated+collagen+matrix+as+a+model+for+the+screening+of+analgesic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds.</a> Cells. 11 (2), 247(2022).</li>
<li>Frias, B., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin%2C+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Capsaicin, nociception and pain.</a> Molecules. 21 (6), 797(2016).</li>
<li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE-dependent+potentiation+of+TRPV1+currents+in+sensory+neurons+exposed+to+high+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose.</a> PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+activity+and+substance+P+release+are+required+for+corneal+cold+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception.</a> Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).</li>
<li>Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+TRP+channels%3Athe+key+transducers+of+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Vetter, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Nav+types+endogenously+expressed+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).</li>
<li>Dekker, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+Nav1.8+expressed+in+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).</li>
<li>Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+recombinant+human+TRPV1+receptors+expressed+in+SH-SY5Y+human+neuroblastoma+cells+increases+%5BCa2%2B%5Di+initiates+neurotransmitter+release+and+promotes+delayed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death.</a> J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).</li>
<li>Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+the+desensitization+of+capsaicin+responses+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).</li>
<li>Tominaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cloned+capsaicin+receptor+integrates+multiple+pain-producing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli.</a> Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido all-trans retinóico</td><td>Tocris</td><td>695</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Tocris</td><td>TOCR-2837</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795</td><td></td></tr><tr><td>Borboleta tipo 23GA estéril</td><td>Beckton Dickinson Asepto</td><td>38833814</td><td>Conjunto de veias do couro cabeludo</td></tr><tr><td>Capsaicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>meio basal</td></tr><tr><td>D-ribose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7500</td><td></td></tr><tr><td>D-threose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7392</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 Kit de ensaio de fluxo de cálcio</td><td>Abcam</td><td>ab112129</td><td>Sem lavagem</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>A5670801</td><td></td></tr><tr><td>alto teor Exibição&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LASX</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Software de microscopia</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP8</td><td>Microscópio confocal</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140130 placa de</td><td></td></tr><tr><td>Petri (35/10 mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>627965</td><td></td></tr><tr><td>Cauda de rato tipo I colágeno</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>Merck</td><td>94030304-1VL</td><td>Linha celular de neuroblastoma</td></tr></tbody></table>

produtos finais de glicação avançada sensibilizam células neuronais sensoriais humanas ao influxo de cálcio induzido por capsaicina

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Este manuscrito descreve como preparar gânglios da raiz dorsal intactos para gravações de patch clamp. Esta preparação mantém o microambiente para neurônios e células gliais satélites, evitando assim as alterações fenotípicas e funcionais observadas usando neurônios DRG dissociados.

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Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Descubra como produtos finais de glicação avançada sensibilizam neurônios sensoriais humanos à capsaicina via canais TRPV1. Este método revela mecanismos de dor em doenças degenerativas.

Produtos finais de glicação avançada sensibilizam células neuronais sensoriais humanas ao influxo de cálcio induzido por capsaicina (Vídeo) | JoVE Journal

Produtos finais de glicação avançada sensibilizam células neuronais sensoriais humanas ao influxo de cálcio induzido por capsaicina

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