Name: Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Aprenda a visualizar a dinâmica da DNA polimerase delta em G-quadruplexes usando microscopia de fluorescência de molécula única. Este método revela vias de troca e mecanismos de replicação do DNA em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
<li>Burgers Garg, P., J, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+that+propagate+the+eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).</li>
<li>Burgers, P. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+replication+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair.</a> Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).</li>
<li>Tsai, M. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+polymerases+catalyze+DNA+replication%2C+repair%2C+and+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation.</a> Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).</li>
<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
<li>Sugino Kawasaki, Y., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+replicative+DNA+polymerases+and+their+role+at+the+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork.</a> Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Shivji Wood, R. D., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+DNA+polymerases+are+used+for+DNA+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).</li>
<li>Campbell Budd, M. E., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+the+eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+repair+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis.</a> Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).</li>
<li>Gao Yang, W., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translesion+and+repair+DNA+polymerases%3A+Diverse+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism.</a> Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).</li>
<li>Bridges, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair%3A+Polymerases+for+passing+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA repair: Polymerases for passing lesions.</a> Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).</li>
<li>Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+protein+dynamics+during+DNA-lesion+bypass+by+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci.+9%22%5BJournal%5D)">Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome.</a> Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).</li>
<li>Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+proteins+play+tag%3A+The+dynamic+nature+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome.</a> Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4-quadruplexes%2C+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">G4-quadruplexes, and genome instability.</a> Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).</li>
<li>Monnat Loeb, L. A., J, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases and human disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).</li>
<li>Bryan Oganesian, L., M, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+relevance+of+telomeric+G-quadruplex+formation%3A+A+potential+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target.</a> Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).</li>
<li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).</li>
<li>Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G-quadruplexes+folding%2Funfolding+dynamics+and+interactions+with+proteins+from+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol%22%5BJournal%5D)">Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy.</a> Biomol. 11 (11), (2021).</li>
<li>Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+conformation+and+dynamics+are+determined+by+loop+length+and+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).</li>
<li>Kusi-Appauh, N., Ralph, S. F., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+G-quadruplex+biology+and+stability+using+single-molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Understanding G-quadruplex biology and stability using single-molecule techniques.</a> J Phys Chem B. 127 (25), 5521-5540 (2023).</li>
<li>Obi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+G-quadruplex+DNA+structures+in+Schizosaccharomyces+pombe+causes+single-strand+DNA+lesions+and+impedes+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).</li>
<li>Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+Werner+syndrome+helicase+and+DNA+polymerase+delta+specifically+facilitate+copying+of+tetraplex+and+hairpin+structures+of+the+d%28CGG%29n+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence.</a> J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).</li>
<li>Clayton Kaguni, L. S., A, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+pausing+in+in+vitro+DNA+synthesis+by+DNA+polymerase+a+from+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).</li>
<li>Sato, K., Martin-Pintado, N., Post, H., Altelaar, M., Knipscheer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+mechanism+of+G-quadruplex+resolution+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multistep mechanism of G-quadruplex resolution during DNA replication.</a> Sci Adv. 7 (39), (2021).</li>
<li>Castillo Bosch,, P,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FANCJ+promotes+DNA+synthesis+through+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures.</a> EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).</li>
<li>Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+through+G-quadruplex+motifs+is+promoted+by+the+Saccharomyces+cerevisiae+Pif1+DNA+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase.</a> Cell. 145 (5), 678-691 (2011).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+efforts+of+replicative+helicase+and+SSB+ensure+inherent+replicative+tolerance+of+G-quadruplex%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci.+%28Weinh%22%5BJournal%5D)">Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex.</a> Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).</li>
<li>Pham, S. Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+quadruplex+DNA-binding+nickel+Schiff+base+complexes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes).</a> Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).</li>
<li>Georgescu, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+asymmetric+polymerase+assembly+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).</li>
<li>Hansen, J. B., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+protein+concentration+determination+using+the+NanoDrop+2000c+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer.</a> J Vis Exp. 33, (2009).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeertsema%2C+HJ+%22in+DNA+Replication%3A+Methods+and+Protocols.%2C+eds+Vengrova%2C+S.%2C+Dalgaard%2C+J%22">in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J</a>. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+fast+polymerase+turnover+in+the+bacterial+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome.</a> eLife. 6, 23932(2017).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).</li>
<li>Sommers, J. A., Estep, K. N., Maul, R. W., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+DNA+synthesis+blockage+by+G-quadruplex+structure+and+bypass+facilitated+by+a+G4-resolving+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of DNA synthesis blockage by G-quadruplex structure and bypass facilitated by a G4-resolving helicase.</a> Methods. , 207-214 (2022).</li>
<li>Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+telomeric+G-quadruplexes+dramatically+inhibit+DNA+synthesis+by+replicative+and+translesion+polymerases%2C+revealing+their+potential+to+lead+to+genetic+change%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change.</a> PLoS One. 9 (1), 80664(2014).</li>
<li>Mueller, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-molecule+characterization+of+enzymes+involved+in+nucleic-acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism.</a> Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).</li>
<li>Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Modelo de DNA de controle de 100 nt</td><td>Tecnologias</td><td></td> de DNA <td>integradas Modelo de controle primário em ensaios de extensão de primer</td></tr><tr><td>Modelo de DNA formador de G4 de 100 nt</td><td>Tecnologias de DNA integradas</td><td>Modelo primário de formação de G4 em ensaios de extensão de primer</td>15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12 poços, 20 &micro;<td></td></tr><tr><td> L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>Eletroforese em gel</td></tr><tr><td>20 nt oligonucleotídeo de primer marcado/biotinilado Tecnologias</td><td></td><td></td> integradas <td>de DNA Necessário para a extensão do primer dos modelos de DNA de controle de</td></tr><tr><td>22 nt Tecnologias</td><td></td><td></td> de DNA <td>integradas Modelo de controle primário em experimentos de espectroscopia de dicroísmo circular Modelo</td></tr><tr><td>de DNA formador de G4 de 22 nt</td><td>DNA integrado Tecnologias</td><td></td><td>Modelo primário de formação de G4 em experimentos de espectroscopia de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>24 x 24 mm lamínula</td><td>Marienfeld Superior</td><td>100062</td><td>Necessário para microscopia TIRF</td></tr><tr><td>3-aminopropiltrietoxissilano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>Funcionalização de lamínula</td></tr><tr><td>laser de 647 nm Coerente</td><td></td><td>1196627</td><td>Selecione o comprimento de onda para corresponder à coloração/corante de escolha</td></tr><tr><td>Filtro de emissão de 670 nm</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>Garante que apenas os comprimentos de onda relevantes sejam deixados passar para o detector</td></tr><tr><td>Amersham Typhoon 5 imager biomolecular</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>Análise em gel</td></tr><tr><td>Biotina-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Funcionalidade de lamínula</td></tr><tr><td>Desoxinucleotídeos mistura de solução de trifosfato</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>Blocos de construção de replicação</td></tr><tr><td>Banho seco digital (115V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>Soluções de aquecimento</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td>Redução da ligação dissulfeto</td></tr><tr><td>Câmera EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>Captura de filmes de molécula única</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>DNA desnaturando durante ensaios de replicação de DNA de conjunto</td></tr><tr><td>Seringa à prova de gás, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>Cubeta de enchimento para espectroscopia de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>Microscópio invertido com CFI Apo TIRF 100x objetiva de imersão em óleo</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Facilita a microscopia TIRF de molécula única</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro J-810</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>Medição de espectroscopia de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>Funcionalidade de lamínula</td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotômetro</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>Medição de concentrações</td></tr> <tr><td>de proteínas e rótulosNeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Modelos de DNA de amarração para as lamínulas funcionalizadas durante experimentos de molécula única Tubulação</td></tr><tr><td>de polietileno</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>Necessário para a construção da célula de fluxo</td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo, 10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>Contém amostra para espectroscopia de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>Usado para fluir tampões e substratos através de uma célula de fluxo microfluídica</td></tr><tr><td>Tampão Tris-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td><td>Tampão de solução de DNA</td></tr><tr><td>Polimerase de levedura &delta;</td><td>Michael O'Donnell Lab</td><td></td><td>Replicando os modelos de DNA</td></tr><tr><td>Coluna de dessalinização de spin Zeba, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>Purificação da polimerase</td></tr></tbody></table>

visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da dna polimerase em g-quadruplexes

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

Para este ensaio, dois substratos de DNA com um primer de 20 nt marcado com fluorescência foram projetados: um contendo uma sequência formadora de G4 (Figura 1A, à esquerda) e outro sem essa sequência (Figura 1A, à direita). Para confirmar que o G-quadruplex é um obstáculo eficaz à atividade da polimerase, a síntese de DNA por Pol δ foi monitorada em um gel PAGE desnaturante. A atividade do Pol δ purificado marcado nos substratos de DNA foi examinada por eletroforese em gel. A Figura 1B (à esquerda) mostra que o Pol marcado com fluorescência δ é incapaz de sintetizar além do G-quadruplex. Antes do início da síntese (t = 0 min), uma banda correspondente a 20 nt está presente, representando o primer marcado que foi desnaturado da fita molde. Após 3 min, essa banda de 20 nt foi convertida em uma banda de 60 nt, indicando que a síntese ocorreu em todo o DNA e confirmando que a polimerase foi completamente bloqueada pela estrutura G-quadruplex. Esse bloqueio implica que a polimerase não pode se desdobrar nem contornar a estrutura. Em contraste, a síntese de um modelo de controle que não contém a sequência de formação de G-quadruplex (Figura 1A, direita) produziu uma banda de 100 nt após 3 min (Figura 1B, direita).
Após a confirmação da síntese nos moldes e o bloqueio eficiente pelo G-quadruplex, essas medições foram repetidas em um microscópio de fluorescência de molécula única para monitorar o comportamento da polimerase. Os moldes de DNA foram amarrados a lamínulas funcionalizadas (Figura 2A) em uma célula de fluxo microfluídico, e a posição de cada substrato foi determinada pela visualização do primer marcado com fluorescência. Em seguida, Pol δ rotulado foi carregado na presença de dNTPs para iniciar a síntese. Dentro de um FOV típico, manchas individuais são rastreadas para quantificar a frequência com que Pol δ se liga e se dissocia do DNA (Figura 2B, C). Medindo a intensidade em função do tempo em cada substrato de DNA, trajetórias de molécula única podem ser geradas (Figura 2C, Figura Suplementar 3). A característica "tempo de permanência", ou a duração média em que Pol δ permanece vinculado ao modelo, pode ser medida. Para o substrato G4, o tempo de permanência foi determinado em 6 s ± 2 s, enquanto para o substrato controle, foi de 10 s ± 3 s (Figura 2D, Figura Suplementar 4). Além disso, para cada trajetória, o número de vezes que Pol δ se liga ao modelo pode ser quantificado. O número de eventos de ligação ao substrato G4 é muito maior em comparação com o modelo de controle (Figura 2E). Embora haja instâncias de mais de um evento de associação no modelo de controle devido à associação e desvinculação escolar, há um claro aumento no número de eventos de associação em média para o modelo de formação de G4. Isso sugere que, após a síntese ser interrompida pelo G-quadruplex, a polimerase ligada se dissocia do DNA antes que novas polimerases da solução envolvam um ciclo contínuo de ligação e desligação. Portanto, este ensaio de molécula única fornece uma visão incomparável de como as DNA polimerases respondem aos bloqueios de DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
Figura 1: Ensaio de extensão do primer do conjunto. (A) Representação esquemática dos substratos de DNA. O substrato G4 (à esquerda) contém uma sequência de formação de G-quadruplex, enquanto o substrato de controle (à direita) não. (B) Ensaio de extensão de primase de DNA de conjunto do G4 preparado e substratos de DNA de controle mostrando que a levedura marcada com fluorescência Pol δ é totalmente bloqueada pelo G-quadruplex. O gel PAGE mostra a replicação dos moldes de DNA ao longo do tempo, resultando em uma mudança do primer de 20 nt marcado para o produto de 60 nt para o substrato G4 (à esquerda) e o produto de 100 nt para o modelo de controle (à direita). M representa uma escada contendo oligos marcados de 20 nt, 60 nt e 100 nt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
Figura 2: Microscopia de fluorescência de molécula única. (A) Representação esquemática do ensaio de extensão de primer de molécula única usando levedura marcada com AF647 Pol δ. (B) FOV típico obtido de um ensaio de molécula única. Cada mancha representa um Pol marcado com fluorescência δ ligação a um molde de DNA. Barra de escala: 10 μm. (C) (Topo) Exemplo de molécula do ensaio de molécula única mostrando a ligação liga/desliga à medida que o Pol δ troca. (Abaixo) Trajetória de molécula única da mesma molécula mostrando a intensidade ao longo do curso de tempo do experimento. A linha preta representa o ajuste do Modelo de Markov Oculto (HMM) aos dados. (D) Tempo de permanência do Pol δ no substrato G4 (roxo) e no substrato controle (cinza). As linhas representam ajustes exponenciais, dando uma vida útil de 6 s ± 2 s no substrato G4 e 10 s ± 3 s no substrato de controle. (E) Número de eventos de ligação de Pol δ a substratos de DNA únicos. O número médio de eventos de ligação no substrato G4 (roxo) é 3,5, em comparação com o substrato de controle 1 (cinza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura Suplementar 1: Espectroscopia CD. Espectros CD da sequência de formação de G4 (roxo) e controle (cinza) em tampão TE contendo 200 mM de KCl a 25 ° C. O pico característico em 260 nm, seguido pelo pico negativo em 240 nm, é característico de um GQ intramolecular paralelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Construção da célula de fluxo. (A) Esquema das peças individuais da célula de fluxo. O bloco quadrado do PDMS fica no topo da lamínula do microscópio. Essas peças são então encaixadas dentro da tampa e da parte inferior do suporte da célula de fluxo. (B) A célula de fluxo completa. Os tubos podem ser inseridos em cada lado do bloco PDMS para formar os canais através dos quais os buffers podem fluir através do dispositivo por meio de microfluídica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Trajetórias de molécula única. (A) Exemplo de trajetória de uma molécula passando por um único evento de ligação durante o período de 10 minutos do experimento. (B) Exemplo de trajetória de uma molécula submetida a eventos de ligação zero durante o período de 10 minutos do experimento. A linha preta em (A) e (B) representa o ajuste do Modelo de Markov Oculto (HMM) aos dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 4: Tempos de permanência. (A) Tempo de permanência do Pol δ no substrato G4. A linha representa o ajuste exponencial, dando uma vida útil de 6 s ± 2 s. (B) Tempo de permanência de Pol δ no substrato de controle. O ajuste exponencial dá uma vida útil de 10 s ± 3 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 5 suplementar: Controle de fotobranqueamento. O gráfico mostra o tempo médio para uma enzima Pol δ de levedura marcada com AF647 individual ser fotobranqueada pelo laser de 647 nm. A linha representa o ajuste exponencial, dando uma vida útil de 39 ± 6 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

single-molecule-fluorescence-visualization-dna-polymerase-dynamics-at

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J.

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) usando um substrato de DNA modificado site-specifically λ e um ponto quântico rotulado de proteína.

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) são sondas químicas úteis para identificar e caracterizar estruturas G-quadruplex em modelos de DNA in vitro. Este protocolo detalha o procedimento para realizar reações de sondagem com B-CePs e para resolver produtos da reação por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução.

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Relatamos um ensaio de conjunto híbrido e molécula única para obter imagens diretas e quantificar o movimento de helicase Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) totalmente reconstituída e marcada com fluorescência em moléculas de DNA lineares mantidas no lugar em uma armadilha óptica.

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Aprenda a visualizar a dinâmica da DNA polimerase delta em G-quadruplexes usando microscopia de fluorescência de molécula única. Este método revela vias de troca e mecanismos de replicação do DNA em tempo real.

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Explorar mais vídeos