Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Nosso trabalho se concentra no desenvolvimento e uso da metodologia de molécula única para estudar a dinâmica em sistemas biológicos complexos. Em particular, estamos interessados em aprender como as DNA polimerases se comportam ao encontrar obstáculos, neste caso, G-quadruplexes. Desenvolvemos um método de molécula única baseado na visualização de fluorescência que nos permite ver o comportamento de DNA polimerases individuais ao encontrar um G-quadruplex.

Com nosso ensaio, identificamos uma via de troca anteriormente não caracterizada para a DNA polimerase delta ao atingir G-quadruplexes, na qual a polimerase cairá e uma nova se ligará novamente. Com nosso protocolo desenvolvido, finalmente respondemos à pergunta: Como diferentes DNA polimerases se comportam quando encontram um G-quadruplex, pois podemos ver em tempo real como a cinética e a mecânica mudam com o tempo? Para começar, remova uma lamínula funcionalizada de um aspirador e coloque-a em um micro rack de tubos parcialmente cheio de água para criar um ambiente úmido.

Pipete 100 microlitros de um tampão de bloqueio em um tubo, adicione 25 microlitros de solução de NeutrAvidina e misture bem. Espalhar a solução sobre a superfície da lamínula e deixá-la incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente na caixa húmida. Em seguida, lave a lamínula com água e seque-a com gás nitrogênio.

Coloque um bloco de polidimetilsiloxano feito sob medida na lamínula dentro de um suporte de célula de fluxo. Insira tubos de polietileno nos orifícios da célula de fluxo. Agora, aqueça alíquotas de um mililitro de tampão de bloqueio de Tween, 500 microlitros de tampão de lavagem e tampão de replicação a 40 graus Celsius por 15 minutos para liberar gases das soluções.

Desgaseifique as soluções em uma câmara de vácuo por mais 15 minutos a 800 milibares abaixo da pressão atmosférica. Aplique uma gota de óleo na objetiva. Pegue uma célula de fluxo construída e coloque-a no microscópio stage.

Em seguida, levante o objetivo para atender a lamínula. Insira o tubo de entrada no tampão de bloqueio Tween desgaseificado e conecte a saída à bomba de seringa. Em seguida, puxe a seringa para puxar o tampão de bloqueio de interpolação através do tubo para o canal.

Fluxo de 200 microlitros de tampão de lavagem desgaseificado no canal a uma taxa de 100 microlitros por minuto para liberar o tampão de bloqueio de interpolação. Agora, dilua as soluções de molde de DNA para 0,5 picomolar em 500 microlitros de tampão de replicação. Deixe 150 microlitros da solução fluírem para o canal a uma taxa de 10 microlitros por minuto.

Ilumine a amostra usando um laser de 647 nanômetros a aproximadamente 900 miliwatts por centímetro quadrado no plano da amostra para visualizar modelos de DNA individuais. Uma vez que uma densidade suficiente de manchas seja visível, flua em uma nova solução de tampão de replicação para lavar o excesso de DNA. Mova-se para um novo campo de visão e capture uma imagem do DNA para determinar o grau de colocalização entre a polimerase marcada e o substrato de DNA.

Depois de concluído, aumente a potência do laser para fotobranquear os pontos restantes. Em seguida, prepare uma solução de polimerase contendo ditiotreitol, dNTPs e uma sonda fluorescente no tampão de replicação. Fluxo em 100 microlitros da solução de polimerase a uma taxa de cinco microlitros por minuto no canal.

Quando a amostra estiver em foco e o ângulo de fluorescência de reflexão interna total tiver sido ajustado, defina a potência do laser de 647 nanômetros para aproximadamente 900 miliwatts por centímetro quadrado no plano da amostra. Comece a criar imagens do campo de visão pelo período de tempo desejado. A sequência G-quadruplex bloqueou a síntese da polimerase delta, conforme indicado pela presença de uma banda de 60 nucleotídeos no gel de página, enquanto o substrato de controle sem o G-quadruplex produziu uma banda de 100 nucleotídeos.

A microscopia de fluorescência de molécula única confirmou que a polimerase delta teve um tempo de permanência mais curto de seis mais ou menos dois segundos no substrato G-quadruplex, em comparação com o substrato de controle, que teve um tempo de permanência de 11 mais ou menos três segundos. O número de eventos de ligação da polimerase delta foi significativamente maior no substrato G-quadruplex em comparação com o controle, sugerindo múltiplos ciclos de ligação e desligação devido ao bloqueio da síntese.