Name: Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio in vivo com microscopia de dois fótons na camada 2/3 do córtex de ratos. Este método permite registrar atividade de populações densas de neurônios com resolução de célula única.

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Gostaríamos de agradecer Olga Garaschuk para discussões úteis sobre como otimizar o carregamento a granel de indicadores de cálcio.

<ol><li> Prepare a solução indicador fluorescente de cálcio. Nós usamos corantes éster acetoxymethyl, ou AM corantes para breve. Estes são corantes que podem ser absorvidas pelas células quando injetado extracelularmente. Normalmente usamos Oregon-Green-BAPTA 01:00 ou 04:00 Fluo-a uma concentração de 1 mM. Corantes AM podem ser obtidas Invitrogen em frascos de 50 microgramas. Primeiro, preparar uma solução de 20% dos PLURONIC F-127 em DMSO. Nós aquecer a solução antes de usar todos os dias até a sua clara. Nós dissolver o indicador de cálcio F-127/DMSO PLURONIC 20% por 15-20 minutos a uma concentração de 10 mM. Em seguida, diluir a solução de 1mM em uma solução contendo, em mM: NaCl 150, KCl 2,5, 10 Hepes, pH 7.4. Além disso, 100 Sulforhodamine M 101 é normalmente incluído para astrócitos rótulo e visualize a pipeta durante a injecção. Nós filtrar a solução antes da injeção com um filtro de 0,49 micron centrífuga (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006). </li><li> Implante uma janela cranial sobre a área a ser trabalhada. Temos <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">descreveu a abordagem geral em JOVE</a> , mas as seguintes modificações são importantes para a injeção de corante de cálcio: Fazer uma pequena craniotomia de 2 mm de diâmetro sobre a área cortical de interesse, tomando extremo cuidado para não danificar a dura-máter subjacente. Garantir uma lamela no lugar sobre a craniotomia, mas apenas parcialmente cobrir a craniotomia, deixando um pequeno espaço entre a borda da craniotomia e da lamela de vidro para permitir espaço para uma pipeta para entrar no córtex obliquamente. Antes da injeção, faça um buraco raso com cimento dental ao redor do craniotomia. O bem deve estender-se em direção rostral e ser rasa o suficiente para permitir a inserção da micropipeta de injeção. </li><li> Transferir o mouse transferido para o estágio do microscópio e imobilizar a cabeça, como mostra a nossa <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">imagem de vídeo no fluxo sanguíneo</a> . </li><li> Puxe pipetas de vidro de microeletrodos para um diâmetro da ponta rendendo 2-4 Ohms mega na resistência, usando um extrator pipeta. Carregar o mix de cálcio corante indicador para a pipeta de vidro, utilizando uma micro. Usando um micromanipulador, delicadamente abaixar a micropipeta sobre a superfície do cérebro usando uma objetiva de 4X, que é então finamente posicionado sob objetiva de 40X. Escolha um local adequado para injeção, de tal forma que existem vasos sobrejacente poucos ou nenhum sangue para obscurecer a imagem. Utilizando dois fótons de microscopia, a ponta da pipeta é visualizado e avançado lentamente no córtex, a uma profundidade de 200 micrômetros abaixo da dura-máter. Então, a pressão de injetar a mistura de corante em 10 PSI por 1 minuto usando um Picospritzer. Costumamos oferecer 2-4 injeções da mistura de corante de cálcio AM, separados no espaço por cerca de 200-300 microns. Esta abordagem carregamento a granel de injeções ligeiramente sobrepostos garante que uma área tão grande como 600 x 600 mícrons é adequadamente manchada para imagens de cálcio. Começar uma hora de imagens após a injeção da mistura de corante AM, para permitir o corante para difundir e ser absorvido pelos neurônios. </li><li> Realizar in-vivo de dois fótons de imagem com um custom made microscópio de dois fotões utilizando um Chameleon Ti-Safira Laser (ajustado para 800-880 nm) e espelhos galvanômetro Cambridge Technology. Nós adquirir imagens utilizando Software scanimage desenvolvido em laboratório Karel Svoboda do (Pologruto et al., 2003). Potência do laser é tipicamente bem abaixo de 70 mW na amostra. Imagens campo inteiro são adquiridos utilizando uma 20X (0,95 NA) ou 40x (0.8 NA) objetivos Olympus, no 1,95-15,63 frames por segundo (512 x 256 pixels para 256 x 64 pixels). Varreduras de linha são adquiridas a 500 Hz. Durante a gravação, os animais são mantidos sob anestesia com isoflurano luz (0,6-0,9%), e também são mantidos a 37 ° C usando um aparelho de Harvard dispositivo de controle de temperatura. Cuidado é tomado para manter a freqüência respiratória dos animais, enquanto cerca de 100 respirações / minuto possível. Este nível de uso de anestesia é o nível mais baixo que imobiliza o animal, mas ainda permite a atividade espontânea a ser gravado. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

A vantagem deste método sobre gravações eletrofisiológicas é que é menos invasiva e permite que as gravações da atividade neuronal em densas redes neuronais. Ao fazer este procedimento é importante lembrar de tomar extremo cuidado ao realizar a craniotomia para não danificar a dura. Mesmo uma pequena quantidade de sangramento subdural com muito obscura a imagem.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforodamina 101</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Plurônico F-127 em DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Centrífugo (0,45 mícron)</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo em 2-photon imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos ratos

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução. O método consiste na implantação de uma janela de imagem do crânio, a injeção de um corante indicador fluorescente de cálcio que podem ser tomadas por um grande número de neurônios e, finalmente, gravar a atividade dos neurônios com o tempo de imagem usando um lapso de cálcio in-vivo duas microscópio de fótons. Co-injeção de astrócitos específicos corantes permite diferenciar os neurônios de astrócitos. A técnica pode ser realizada em camundongos expressando moléculas fluorescentes em subpopulações específicas de neurônios para entender melhor as interações de rede de diferentes grupos de células.

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Para compreender a dinâmica de rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial registrar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios.

Para compreender a dinâmica das redes de microcircuitos no neocórtex, é essencial registrar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In vivo. A imagem de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma população densa de neurônios com resolução em nível celular.O método consiste em implantar uma janela craniana de imagem e injetar um corante fluorescente de cálcio que pode ser absorvido por um grande número de neurônios, e finalmente registrar a atividade neuronal por meio de imagens de cálcio com lapso de tempo. Olá, sou Payman Go do laboratório de Carlos Portera-Caio, do Departamento de Neurologia da Escola de Medicina David Geffen na UCLA. Em vídeos anteriores, nosso laboratório demonstrou um procedimento para realizar craniotomia e imagem de fótons para o fluxo sanguíneo em camundongos.Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar imagem de cálcio por fótons in vivo em camundongos. Então vamos começar. Antes de iniciar, a solução para injeção do corante deve ser preparada.Primeiro, prepare a solução indicadora fluorescente de cálcio. Utilizamos corantes éster etila ou corantes AM, abreviadamente. São corantes que podem ser absorvidos pel

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual.

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Aprenda a realizar imagem de cálcio in vivo com microscopia de dois fótons na camada 2/3 do córtex de ratos. Este método permite registrar atividade de populações densas de neurônios com resolução de célula única.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

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