Otimizando o isolamento e a purificação de células mesangiais glomerulares murinas

Um de nossos focos de pesquisa é a insuficiência renal relacionada ao mieloma múltiplo. Para apoiar nossa pesquisa, desenvolvemos e agora otimizamos protocolos para cultura primária de células mesangiais murinas. O equipamento necessário para os procedimentos é facilmente acessível e as etapas processuais são diretas.

A aquisição de células-alvo requer apenas duas a três semanas. Essa técnica facilita a pesquisa renal e apóia estudos que investigam a função das células mesangiais em modelos de doenças, desenvolvimento terapêutico ou pesquisa de transdução de sinal. Para iniciar o isolamento das células mesangiais murinas, ou MCs, do animal devidamente sacrificado, usando tesouras e pinças, remova assepticamente os rins do camundongo e coloque-os em uma placa de Petri.

Enxágue os rins com a solução salina balanceada de Earle e, em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente o tecido conjuntivo e a cápsula renal. Corte verticalmente o rim pela metade usando um bisturi. Adicione três a quatro mililitros de solução de colagenase I à placa de Petri e triture bem o tecido com um pilão de células plásticas.

Pipete todo o tecido e solução da placa de Petri em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enxágue a placa de Petri com um a dois mililitros de solução de colagenase I para garantir a transferência completa do tecido. Coloque o tubo em um agitador a 37 graus Celsius, agitando a 120 rotações por minuto por 30 minutos.

Em seguida, adicione um volume igual de solução de parada ou meio de cultura um à mistura. Pipete a solução do tubo de centrífuga e passe-a por um filtro de células de 100 mícrons. Recolher o filtrado num tubo de centrifugação de 50 mililitros.

Passe o filtrado por um filtro de células de 40 mícrons, retendo apenas as células no filtro. Enxágue o filtro repetidamente com o meio de cultura um para maximizar a coleta de células. Transfira as células coletadas do filtro para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Centrifugue a suspensão a 600g por cinco minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, ressuspenda as células em uma placa de cultura de células de acordo com a densidade celular desejada. Coloque os pratos em uma incubadora de células a 37 graus Celsius com 95% de ar e 5% de dióxido de carbono.

Adicione um a dois mililitros de PBS ao longo da borda interna da placa de cultura para enxaguar as células. Use uma pipeta para remover todo o PBS do fundo do prato e, em seguida, adicione 10 mililitros de meio de cultura, um ao longo da borda interna do prato. Quando as células atingirem 80% de confluência, geralmente dentro de sete a 10 dias, lave as células duas vezes com PBS estéril.

Adicione a solução de tripsina a 0,25% ao prato para tripsinizar as células. Coloque o prato em uma incubadora de 37 graus Celsius. Quando a maioria das células exibir uma morfologia arredondada e se desprender da superfície, termine a tripsinização adicionando um volume igual de meio dois.

Centrifugue as células a 600g por cinco minutos em temperatura ambiente e, em seguida, ressuspenda-as no meio dois. Os MCs isolados neste estudo exibiram expressão significativamente alta de alfa-SMA, fibronectina e vimentina. A coloração imunofluorescente de MCs purificadas e cultivadas realizada após 10 dias de cultura no meio dois mostrou que mais de 95% das células expressaram alfa-SMA e vimentina.