Determinação da morfologia mitocondrial em células vivas usando microscopia confocal

Nossa pesquisa se concentra na neurofarmacologia básica. Especificamente, estudamos como as moléculas de drogas funcionam. Nosso objetivo é entender a relação entre potenciais compostos de drogas e a função mitocondrial na doença de Parkinson.

Estudos anteriores analisam os desafios de análise de células de laboratório de longa data, mesmo com as diretrizes do fabricante. Para resolver isso, delineamos um protocolo passo a passo detalhado para avaliar a morfologia mitocondrial em células de laboratório. Nosso protocolo usa uma coloração mitocondrial simples, imagem de fluorescência e software de código aberto.

Isso reduz custos, aumenta a acessibilidade e facilita o uso do que alternativas complexas como microscopia eletrônica. Para começar, obter culturas de células SH-SY5Y cultivadas em frascos contendo DMEM/F12, suplementadas com 10%FBS. Separe as células por um minuto usando uma solução de tripsina a 0,05%.

Em seguida, centrifugue as células a 100 G por três minutos antes de passar. Em seguida, suspenda as células SH-SY5Y em meio DMEM/F12 suplementado com 1%FBS. Em seguida, semeie as células em pratos confocais com fundo de vidro e mantenha-as durante a noite.

Para MPP+estimulação, substituir o meio de cultura por meio fresco com ou sem 1-metil-4-fenilpiridínio durante 24 horas. Para a coloração MitoTracker, dilua a solução estoque MitoTracker com meio DMEM/F12 pré-aquecido para obter uma concentração de trabalho de 50 nanomolares. Mantenha a solução de coloração protegida da luz durante todo o procedimento.

Remova o meio de cultura dos pratos confocais. Lave as células duas vezes com DMEM/F12 novo. Em seguida, pipete um mililitro da solução de trabalho MitoTracker no prato.

Incube por 15 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Agora remova a solução de trabalho MitoTracker e lave a louça duas vezes com DMEM/F12. Após a última lavagem, adicione um mililitro de DMEM/F12 a cada prato.

Incube na incubadora de células antes de obter imagens. Para pré-equilibrar o microscópio confocal para imagens, sob o painel de aquisição, ajuste os parâmetros do caminho da luz definindo os comprimentos de onda de excitação e emissão. Defina o tamanho do orifício para 1,2 unidades arejadas, o tamanho da varredura de pixels para 1024 por 1024, o tempo de permanência do pixel para 2,4 microssegundos com média de dois.

Agora use a luz halógena para focar nas células usando uma lente objetiva apocromática plana de 60X com uma abertura numérica de 1,4, minimizando a fototoxicidade. Ajuste a potência do laser e a alta tensão logo abaixo do nível de saturação. Em seguida, defina o fator de zoom para três e capture as imagens.

Mova a região de interesse para focar em outras células sob o microscópio. Em seguida, capture imagens sem alterar nenhuma configuração. Para melhorar a qualidade da imagem antes da transformação binária e da esqueletização, primeiro abra a imagem.

Selecione uma área de uma única célula usando a ferramenta ROI. Agora, clique sequencialmente no processo, filtros, função de máscara de nitidez para aumentar a nitidez. Em seguida, use o processo e aprimore o contraste para reduzir a amplificação de ruído.

Clique em processo, filtros e na opção mediana para remover o ruído de sal e pimenta. Para converter a imagem em binária, clique em processo seguido de binário e escolha a opção tornar binário. Esqueletize a imagem binária clicando em processar, binário e esqueletizar.

Em seguida, agrupe todos os pixels do esqueleto selecionando analisar, seguido pelo esqueleto e analisar a função 3D 2D do esqueleto. Simplifique a análise usando a ferramenta MiNA para calcular nove parâmetros descritivos na imagem esqueletizada. A intensidade de fluorescência da coloração mitocondrial aumentou progressivamente com a concentração de CMXRos vermelhos do MitoTracker de 25 nanomolares para 200 nanomolares.

Mas em 200 nanomolares, foi observada uma coloração substancial do fundo citoplasmático. A morfologia mitocondrial foi melhor preservada no meio DMEM/F12 em comparação com PBS uma hora após a coloração, embora o DMEM/F12 também tenha apresentado maior fluorescência de fundo. A média de quadro duplo melhorou significativamente a relação sinal-ruído na imagem mitocondrial em comparação com o modo de varredura única.

E aumentar o tempo de permanência do pixel de 2,4 para 10,8 microssegundos resultou em imagens mais brilhantes, mas causou fotobranqueamento. O aumento da alta tensão intensificou o ruído de fundo, enquanto o aumento da potência do laser levou ao fotobranqueamento. A ferramenta MiNA produziu saídas de esqueletização consistentes para imagens fracas e brilhantes, indicando segmentação robusta em diferentes intensidades de fluorescência, com a imagem brilhante exibindo intensidade 5,5 vezes maior do que a imagem fraca.

O tratamento com MPP+ a 500 micromolares interrompeu a morfologia mitocondrial em células SH-SY5Y em comparação com o controle não tratado, resultando em uma pegada mitocondrial significativamente reduzida.