Name: Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias de células BV-2 microgliais e detectar glicanos N-ligados por espectrometria de massa IR-MALDESI. Este protocolo avança o conhecimento sobre interações neuroimunes em distúrbios cerebrais.

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<ol><li>Dos Santos, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+microglial+cell+densities+across+brain+structures+and+mammalian+species%3A+Implications+for+brain+tissue+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function.</a> J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).</li>
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<li>Barry, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+antiretroviral+drugs+in+tissue+by+IR-MALDESI+MSI+coupled+to+the+Q+exactive+and+comparison+with+LC-MS%2FMS+SRM+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham 600 imager</td><td>Cytvia&nbsp;</td><td>29194217</td><td>Imager de gel e membrana</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess 3</td> Padrão <td>de Banho Seco X003SZ1LY9</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>4 blck 100-120V</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>88870003</tr><tr><td>i-Blot2 Dispositivo de transferência de gel</td><td>Invitrogen</td><td>IB21001</td><td>Sistema de transferência de Western blot</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Cell Treat</td><td>04355223EA</td><td></td></tr><tr><td>Leitor</td><td></td> de microplacas <td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>Mini tanque de gel</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Open Air Rocker</td><td>Fisher Marca</td><td>88861025</td><td></td></tr><tr><td>Menino Pipet&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Integra- VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de isolamento de mitocôndrias&nbsp; Kit de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>isolamento mitocondrial</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>89874</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Fosfatase</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>1861274</tr><tr><td>Inibidor de Protease</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>N-glicano e reagentes IR-MALDESI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11350</td><td>50% em ESI solvente</td></tr><tr><td>Acetonitrila&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-4L</td><td>1 mM em solvente ESI</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio&nbsp;</td>Solução <td>de Calibração A643500</td><td>100 mM</td> <td>da Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Scientific Thermofisher Scientific</td><td>A39239</td><td>Pierce FlexMix</td></tr><tr><td>Dithiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AC426380100</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A322-10VL</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS grau água</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>047146.M6</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>Bulldog Bio</td><td>NZPP010</td><td>75000 U/mL, enzima para liberação de N-glicano&nbsp;</td></tr><tr><td>Isolamento de N-glicano e consumíveis IR-MALDESI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon filtros centrífugos</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>UFC501024</td> Espectrômetro de massa <td>MWCO de 10 kDa</td></tr><tr><td></td><td>Orbitrap Exploris 240</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mid-IR Laser</td><td>JGM Associates, Burlington, MA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de micropoço de teflon</td><td>Prosolia, Indianápolis, IN, EUA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>N-glycan analysis softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoMod&nbsp;</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://web.expasy.org/glycomod/</td></tr> <tr><td>GlyConnect</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://glyconnect.expasy.org/</td></tr><tr><td>Isolamento de proteínas e consumíveis de western blot&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basix pontas de carregamento de gel (10 &micro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-102</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de carregamento de gel Basix (200 &micro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-116</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>VWR labs</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>i-Blot NC pilhas regulares</td><td>Invitrogen</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>Blot2 PVDF Regular Stacks</td><td>Invitrogen</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp; &micro; L micropipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBE00010</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L micropipeta</td><td>Invitrogen</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; L micropipeta&nbsp;</td><td>Marca Fisher</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L micropipeta</td><td>Marca Fisher</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp; &micro; Pontas de pipeta em L</td><td>VWR labs</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &micro; Pontas de pipeta L</td><td>VWR labs</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; Pontas de pipeta em L</td><td>VWR labs</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; &micro; Pontas de pipeta L</td><td>VWR labs</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poço&nbsp;</td><td>Marca Fisher</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Isolamento de proteínas e reagentes western blot&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin antibody ( Host : Rabbit )</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>8457T</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG HRP Linked&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus</td><td>Invitrogen</td><td>NW04120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Fisher biorreagentes</td><td>BP9700-100</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo COXIV (Hospedeiro: Coelho)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4844S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH (Hospedeiro: Coelho)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína MicroBCA</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>PÁGINA Régua de proteína pré-fabricada</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>815-968-0747</td><td>Diluição= Use 7&nbsp; &micro; L para carregar no primeiro poço</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Aniara Diagnostics</td><td>A12-9423-5</td><td>Prepare 1x PBS de 10x pó&nbsp;</td></tr><tr><td>Substrato de Blotting Western Pierce ECL</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>32106</td><td>Kit de substrato quimioluminescente</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Amostra</td><td>Novex</td><td>B0007</td><td>O tampão de amostra LDS de parafuso é preparado na proporção de 3:1 de amostra para tampão de amostra</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis de cultura de tecidos&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Slides</td><td>Avantor</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Cell Treat</td><td>414004-265612-5884</td><td></td></tr><tr><td>2 mL pipeta de aspiração</td><td>Vista lab</td><td>5090-0010E</td><td></td></tr><tr><td>5 mL pipeta sorológica&nbsp;</td>Pipeta sorológica <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Basix</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pipeta sorológica</td><td>Vista lab</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>50 mL pipeta sorológica</td><td>Vista lab</td><td>14955233</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cônico</td><td>Avantor</td><td>229225A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo cônico</td><td>Tratamento celular</td><td>4190-0050</td><td></td></tr><tr><td>T-75 cm2 Frasco de cultura de tecidos</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FB012937</tr><tr><td>T-180 cm2 Frasco para cultura de tecidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012939</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes para cultura de tecidos&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV2 linha de células microgliais&nbsp;</td><td>Bioarray Criativo&nbsp;</td><td>CSC-I2227Z</td><td>Microglia de camundongo imortalizada (BV2) derivada da microglia neonatal C57/BL6&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzimas de dissociação celular&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>12563029</td><td>TrypLE&nbsp;</td></tr><tr><td>Meio de Baixo Glicose Modificado Eagle Medium (DMEM) da Dulbecco&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Mínimo Essencial Meio (MEM) Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillium Streptomycin</td><td>Cytivia</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salina</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue mancha 0,4%</td> <td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Mitochondrial Preparation from Microglia for Glycan Analysis

A Figura 1 representa um esboço esquemático das etapas envolvidas no isolamento das mitocôndrias da linha celular microglial BV2 para análise de glicano por espectrometria de massa. A reprodutibilidade do isolamento da proteína mitocondrial entre diferentes preparações mitocondriais a partir da mesma densidade inicial das células microgliais está representada na Figura 2, que não mostra diferença significativa entre a concentração de proteína mitocondrial estima...

Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Understanding the glycosylation patterns of mitochondrial proteins in microglia is critical for determining their role in neurodegenerative diseases. ...

mitochondrial-preparation-from-microglia-for-glycan-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

O vídeo demonstra uma técnica para isolar a microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto. Primeiro, o córtex sofre segmentação e homogeneização para remover neurônios e outras células gliais, preservando a microglia. Em seguida, a suspensão celular é exposta a microesferas magnéticas anti-mielina e a um campo magnético, separando efetivamente as células da micróglia e mielóides dos detritos de mielina e células contendo mielina.

Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Aqui, um protocolo (MitoCeption) é apresentada para transferir mitocôndrias, isolado a partir de células estaminais mesenquimais humanas (MSC), para células estaminais glioblastoma (GSC), com o objectivo de estudar os seus efeitos biológicos sobre o metabolismo SGC e funções. Um protocolo semelhante pode ser adaptado para transferir as mitocôndrias entre outros tipos de células.

MitoCeption: Transferir humano isolado MSC mitocôndrias de células-tronco Glioblastoma

Fornecido aqui é um protocolo para investigar as interações entre a forma nativa, prefibrillar, e fibrilas amiloides maduras de diferentes peptídeos e proteínas com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos e várias áreas do cérebro.

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Este estudo apresenta um método para analisar a morfologia das mitocôndrias baseado em imunomarcação e análise de imagens em tecido cerebral de camundongos in situ. Também descreve como isso permite detectar alterações na morfologia mitocondrial induzidas pela agregação de proteínas em modelos da doença de Parkinson.

Exame histológico da morfologia mitocondrial em modelo de doença de Parkinson

Este protocolo descreve uma forma econômica de realizar um teste de esforço de glicólise para quantificar a reprogramação metabólica em micróglias primárias de camundongo. Após o isolamento e estimulação inflamatória, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida usando reagentes recém-preparados e ajustados pelo pH, seguida pela normalização proteica para permitir uma avaliação precisa e reprodutível das mudanças glicolíticas.

Investigando a glicólise na microglia primária usando ensaio de fluxo extracelular

Aprenda a isolar mitocôndrias de células BV-2 microgliais e detectar glicanos N-ligados por espectrometria de massa IR-MALDESI. Este protocolo avança o conhecimento sobre interações neuroimunes em distúrbios cerebrais.

Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

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