Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Em termos gerais, nossa pesquisa se concentra em determinar o papel mecanicista dos açúcares, ou glicanos, e como podemos alavancar essas vias de glicosilação celular e subcelular no envelhecimento, bem como nos distúrbios cerebrais. Atualmente, existe uma lacuna no conhecimento sobre o papel e a modulação dos glicanos subcelulares em diferentes fisiopatologias de doenças, incluindo os distúrbios cerebrais agudos e crônicos, como acidente vascular cerebral e Alzheimer. Este protocolo e nossa pesquisa visam avançar o conhecimento sobre o papel dos glicanos nas interações neuroimunes e como essas informações podem ser aproveitadas para projetar terapias melhores e eficientes do sistema nervoso central.

[Narrador] Para começar, obtenha células microgliais BV-2 derivadas de camundongos C57BL/6. Mantenha-os em meio DMEM com baixo teor de glicose suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais. Cultive as células em frascos T175 até atingirem 70 a 80% de confluência. Aspirar o meio do balão. Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio de crescimento. Usando azul de tripano, conte as células. Centrifugue as células num tubo de microcentrífuga de dois mililitros a 500 G durante cinco minutos. Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 800 microlitros de reagente de isolamento mitocondrial A e vórtice em velocidade média por cinco segundos. Em seguida, incube o tubo no gelo por exatamente dois minutos. Adicione 10 microlitros de reagente de isolamento mitocondrial B e vórtice na velocidade máxima por cinco segundos. Incube no gelo por cinco minutos, voando na velocidade máxima a cada minuto. Agora adicione 800 microlitros de reagente de isolamento mitocondrial C e inverta o tubo para misturar. E centrifugue a 700 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros e centrifugar a 3.000 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante que contém a porção citosólica para um novo tubo. O pellet contém as mitocôndrias isoladas. Adicione 500 microlitros de reagente de isolamento mitocondrial C ao pellet e centrifugue a 12.000 G por cinco minutos. Ressuspenda as mitocôndrias isoladas em 50 microlitros de tampão de isolamento de proteína. Deixe a suspensão no gelo por 20 minutos. Aspirar e dispensar três vezes e deixar no gelo por 20 minutos, vórtice antes de usar. Se não estiver totalmente solubilizado, adicione mais 50 microlitros de tampão e piscina no mesmo tubo. Centrifugue a 13.000 G por 10 minutos. Depois de recuperar e congelar o sobrenadante, seque com um concentrador a vácuo. Para a detecção de glicanos liberados, ressuspenda os glicanos secos e ligados em 50 microlitros de água de grau LCMS. Pipete cinco microlitros de glicanos mitocondriais ressuspensos em um ponto de amostra em uma lâmina de micropoço de Teflon. Ionize e detecte N-glicanos no modo de ionização negativa usando um solvente eletrospray consistindo de 60% de acetonitrila e um ácido acético milimolar a uma taxa de fluxo de dois microlitros por minuto e uma tensão de 3,2 quilovolts. Acople o IR-MALDESI a um espectrômetro de massa HRAM ajustado com um poder de resolução de 240.000 largura total na metade do máximo na relação massa-carga 200 para analisar entre 502.000 relação massa-carga no modo de ionização negativa. Identifique manualmente os glicanos ligados a N procurando massas monoisotópicas. Confirme as distribuições isotópicas usando o espaçamento massa-carga para determinar íons duplamente e triplamente carregados com um limite mínimo de fluxo de íons de 1.000 íons por segundo. Converta os espectros de massa bruta para razões massa-carga em massas monoisotópicas neutras. Em seguida, carregue as massas monoisotópicas em uma ferramenta de previsão de estrutura de oligossacarídeos on-line para determinar possíveis composições de glicanos. Confirme as anotações usando um banco de dados de glico com curadoria experimental. Certifique-se de que cada identificação esteja dentro da margem de precisão de medição de massa de 2,5 partes por milhão, contenha o núcleo e a estrutura de glicano ligada e exclua pentose, ácido 3-desoxi-d-mano-oct-2-ulosônico ou monossacarídeos de ácido urônico. As concentrações de proteína mitocondrial obtidas de seis preparações independentes não apresentaram variação significativa, confirmando alta reprodutibilidade. A análise de sangue ocidental mostrou expressão de CoxIV apenas nas frações mitocondriais e GAPDH apenas nas frações citoplasmáticas, confirmando a pureza dos isolamentos mitocondriais e a ausência de contaminação não mitocondrial. Estruturas distintas de N-glicano sialilado, fosforilado e sulfatado foram detectadas em extratos mitocondriais usando IR-MALDESI. Valores quadrados altos testando uma qualidade de ajuste confirmaram a detecção de glicanos ligados a N com um e dois adutos de cloro, confirmando a detecção dessas composições de glicanos usando IR-MALDESI.