Identificação de espécies de micobactérias pelo método de chip de microarranjo de DNA

[Narrador] Esta pesquisa se concentra no diagnóstico molecular em microbiologia clínica. Comparado com os métodos tradicionais de detecção, o método de chip de microarray de DNA para identificação de espécies de micobactérias é altamente sensível, específico e rápido, o que pode fornecer assistência importante para o diagnóstico precoce de pacientes clínicos. Atualmente, os métodos de identificação rápida de micobactérias não tuberculosas são limitados em muitos laboratórios de base, o que afeta diretamente o diagnóstico e o tratamento clínico do paciente. Para começar, defina a temperatura do banho-maria de temperatura constante para 50 graus Celsius e pré-aqueça. Para preparar chips, adicione 200 microlitros de água destilada ao fundo da caixa de hibridização de chips de microarray genético. Coloque o suporte entre as duas colunas de posicionamento dentro da caixa. Coloque cuidadosamente o chip com a frente voltada para cima no suporte e cubra-o com a lamínula de forma que suas quatro saliências fiquem voltadas para baixo, garantindo que a extremidade da lamínula esteja alinhada com a etiqueta na extremidade do chip. Em seguida, prepare tubos de centrífuga de 200 microlitros ou oito tiras de poço de acordo com o número de amostras e rotule-os adequadamente. Aqueça o tampão de hibridização do kit a 50 graus Celsius até que esteja completamente derretido. Após uma mistura completa, centrifugue-o rapidamente em uma microcentrífuga. Alíquota de nove microlitros de tampão de hibridização em cada tubo ou tira preparada. Adicione seis microlitros do produto de PCR correspondente a cada tubo, perfazendo um volume final de 15 microlitros por mistura de reação. Aqueça a mistura de reação de hibridização a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturá-la usando um instrumento de PCR ou banho-maria. Após o tratamento de desnaturação, mergulhe imediatamente a mistura em uma mistura de água gelada e incube por três minutos. Remova a mistura de reação de hibridização do banho de gelo e misture-a pipetando para cima e para baixo duas vezes. Quando não houver mais precipitado floculante branco, adicione 13,5 microlitros da mistura de reação através do orifício de carregamento da lamínula. Cubra e sele rapidamente a caixa de hibridização e registre o número do chip, a posição do microarray e o número da amostra. Agora, coloque as caixas de hibridização seladas horizontalmente no banho-maria de temperatura constante que foi pré-aquecido a 50 graus Celsius. Depois de colocar todas as caixas dentro, inicie o cronômetro por 120 minutos. Após a conclusão da reação de hibridização, retire as caixas de hibridização horizontalmente, desmonte-as e recupere os chips. Coloque imediatamente os cavacos no rack deslizante dentro de um recipiente cheio de solução de lavagem de cavacos I que foi equilibrado à temperatura ambiente e lave-os a 80 a 100 RPM em um agitador de temperatura constante por três minutos em temperatura ambiente. Lave os cavacos novamente com a Solução de Lavagem de Cavacos II no agitador ajustado para 80 a 100 RPM por três minutos em temperatura ambiente. Agora, coloque os chips em uma centrífuga e gire a 100 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Ligue o scanner. Em seguida, abra o software correspondente. Clique no botão Laser Control para permitir que ele pré-aqueça por 10 minutos. Insira informações relacionadas à amostra no software. Depois que o scanner terminar o pré-aquecimento, clique no botão Ejetar. Coloque o cavaco seco firmemente na pequena peça do suporte. Empurre o chip suave e horizontalmente para dentro do compartimento do scanner e clique no botão Carregar. Agora, insira o número do chip no software e clique para selecionar a área de detecção microarray 1 a 4. Clique em Selecionar amostra para escolher as amostras correspondentes para cada microarray. Em seguida, clique em Iniciar detecção para iniciar a varredura de chips. Os resultados da digitalização serão exibidos na tela e salvos automaticamente. Use a página de consulta de dados para realizar consultas de dados e operações de impressão. Depois de concluir todas as operações, desligue o laser, saia do software e, finalmente, desligue o scanner. A validade dos resultados experimentais é confirmada pelo controlo de qualidade, com o controlo positivo a produzir um resultado de detecção do complexo Mycobacterium tuberculosis e o controlo negativo a não produzir micobactérias. A interpretação das amostras de teste começa com casos em que todas as sondas, incluindo aquela com o maior valor de sinal, são negativas, resultando em um relato de ausência de micobactéria. Nas amostras em que apenas a sonda do complexo Mycobacterium tuberculosis apresenta um sinal forte, o resultado é identificado como positivo para esse grupo de espécies. Se a sonda correspondente ao Mycobacterium avium for a única com sinal forte, a amostra é identificada como positiva para o Mycobacterium avium. Se apenas a sonda de controlo interno for positiva e todas as outras forem negativas, o resultado é comunicado como indeterminado, indicando a presença de uma espécie de micobactéria não abrangida pelo kit de deteção.