Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Nossa pesquisa visa entender como a leucemia mieloide aguda desenvolve resistência às terapias aprovadas. Com base na hipótese de que o metabolismo desempenha um papel fundamental. O objetivo final é identificar uma estratégia que possa efetivamente superar essa resistência. A citometria de fluxo, amplamente utilizada na pesquisa de leucemia, é ideal para analisar células em suspensão como células leucêmicas. Sua adaptabilidade o torna uma ferramenta poderosa para o mecanismo molecular de dados. O principal desafio experimental na pesquisa de LMA é desenvolver um protocolo in vivo ideal para o renascimento molecular, que é a célula para modelagem precisa, entendendo o mecanismo subjacente à resistência terapêutica.

[Narrador] Para começar, dobre o joelho do mouse e use a mão não dominante para imobilizar a perna a fim de expor a superfície articular do fêmur onde está localizado o lado da punção. Coloque o polegar na tíbia, o dedo indicador no fêmur e o dedo médio no lado externo dos ossos para estabilizá-los. Enquanto mantém a imobilização, desinfete a área do joelho com álcool isopropílico para afastar os pelos restantes e melhorar a visualização da estrutura óssea. Usando a primeira seringa seca de calibre 25, posicione a agulha no meio da articulação do fêmur e gire-a suavemente para criar um orifício na superfície articular femoral sem aplicar força. Assim que a agulha entrar na medula, retire gradualmente a seringa enquanto a gira. Insira a segunda seringa lavada no orifício criado pela primeira agulha. Aplique vácuo na segunda seringa inserida no fêmur enquanto gira suavemente e retira gradualmente. Transfira a medula óssea extraída lavando o conteúdo da seringa em um tubo de microcentrífuga resfriado contendo 500 microlitros de PBS. Mantenha a amostra no gelo. Aplique uma leve pressão no local da punção usando um cotonete de isopropanol por 30 segundos para estancar qualquer sangramento. Centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando um sistema de aspiração a vácuo, aspire suavemente e descarte o sobrenadante. Adicione 200 microlitros por amostra de solução de coloração de células fluorescentes. Diluído de um a 100 em PBS para rotular as células mortas. Ressuspenda suavemente as células com uma pipeta. Em seguida, incube as células no gelo por 10 minutos, protegidas da luz. Após 10 minutos, centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante usando um sistema de vácuo, adicione 100 microlitros por amostra de anticorpo ultravioleta brilhante HCD 45 395 diluído de um a 100 em PBS contendo 2% de soro fetal bovino para marcar células hematopoiéticas humanas. Incube as células no gelo por 15 minutos, garantindo que estejam protegidas da luz. Centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo. Ressuspenda o pellet em um mililitro de formaldeído a 1,6% em solução de PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, protegido da luz. Após 10 minutos, centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo. Agora adicione um mililitro de metanol 100%, pré-resfriado a menos 20 graus Celsius diretamente nos dois. Incubar as amostras a menos 20 graus Celsius por 30 minutos protegidas da luz. Centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando um sistema de vácuo, aspire e descarte o sobrenadante. Adicione 50 microlitros de solução mista de anticorpos ou solução mista de controle de isotipo a cada amostra. Ressuspenda suavemente as células usando uma pipeta, incube todas as amostras durante a noite a quatro graus Celsius, garantindo que estejam protegidas da luz. Em seguida, centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, lave as células com 1000 microlitros de PBS, ressuspendendo-as suavemente com uma pipeta. Centrifugue as células novamente a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, faça uma segunda lavagem usando 1000 microlitros de PBS e ressuspenda suavemente as células com uma pipeta antes de centrifugar as células novamente a quatro graus Celsius. Após a aspiração, o sobrenadante ressuspende as amostras finais em 200 microlitros de PBS. Esta figura ilustra o fluxo de trabalho, a estratégia de gating e a normalização dos sinais de fosfoproteína intracelular em células da medula óssea de camundongos xenoenxertos derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda tratados com terapia baseada em venetoclax por 15 dias. A estratégia de gating identificou com sucesso células viáveis de leucemia mieloide aguda humana ou LMA com base em perfis de dispersão direta e lateral e positividade de CD45, permitindo uma análise consistente em todos os grupos de tratamento. O tratamento com venetoclax 5-azacitidina e uridina CDZ levou ao aumento da fosforilação de STAT5 e RPS6 em células AML, sugerindo ativação de vias de sobrevivência associadas à resistência. Curiosamente, quando os camundongos foram tratados com Gilteritinibe, o tratamento não reduziu significativamente a fosforilação das proteínas da via FLT3, indicando que a sinalização persistiu apesar da terapia direcionada. O STAT5 fosforilado e o RPS6 fosforilado mostraram o maior aumento na correlação nos níveis de expressão após a terapia baseada em venetoclax, indicando a coativação dessas vias.