Name: Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda citometria de fosfofluxo para analisar vias de sinalização mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide aguda xenotransplantadas. Este método avançado auxilia no desenvolvimento de terapias direcionadas.

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<ol><li>Ferrara, F., Schiffer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukaemia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukaemia in adults.</a> Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).</li>
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<li>Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+reveals+signaling+heterogeneity+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines.</a> Cells. 11 (13), 2072(2022).</li>
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<li>Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+mediate+resistance+to+targeted+therapy+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia.</a> Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).</li>
<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. 
 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
<li>Suni, M. A., Maino, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell signaling proteins.</a> Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).</li>
<li>Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation+and+cellular+signaling+events+by+flow+cytometry%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.</a> Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).</li>
<li>Chen, W., Luu, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).</li>
<li>Perez, O. D., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-proteomic+immune+analysis+by+flow+cytometry%3A+From+mechanism+to+translational+medicine+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level.</a> Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Seringas de 1 mL 25G x 5/8 TW&nbsp;</td><td>BD Biociências</td><td>#309626</td><td>Seringas para aspiração de medula óssea</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>FroggaBio</td><td>#LMCT1,7 bilhões</td><td>Aliquotar as células recuperadas por aspiração de medula óssea</td></tr><tr><td>BD Horizon Brilhante Mancha Buffer</td><td>BD Biociências</td><td>#563794</td><td>Para processos de coloração</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Fidelis Saúde Animal</td><td>Ethiqa XR</td><td>Analgesia para camundongos</td></tr><tr><td>CellDrop FL Ilimitado</td><td>FroggaBio</td><td>#CellDrop FL- UNLTD</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Wisent Inc.</td><td>#311-425-CL</td><td>Meios para células recuperadas por aspiração de medula óssea</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5427 R</td><td>Millipore Sigma</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>CA superior inativado calor bovino fetal do soro</td><td>Wisent Inc.</td><td>#090-450</td><td>Para processos de coloração</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Millipore Sigma</td><td>#F1635</td><td>Permeabilização de células</td></tr><tr><td>anticorpo humanoCD45 [HI30]&nbsp;</td><td>BD Biociências</td><td>#563792</td><td>Anticorpo acoplado a BUV395</td></tr><tr><td>Analisador de células espectrais ID7000</td><td>Sony</td><td></td><td>Analisador de citômetro de fluxo espectral</td></tr><tr><td>Isoflurano 99,9% líquido</td><td>McKesson</td><td>#803250</td><td>Anestesia para camundongos</td></tr><tr><td>Anestésico por inalação de isospire (isoflurano)</td><td>Dechra</td><td></td><td>Anestesia para camundongos</td></tr><tr><td>AO/PI vivo/morto</td><td>FroggaBio</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>Zumbi NIR vivo/morto</td><td>BioLegend+B6:C12</td><td>#423106</td><td>Para citometria de fluxo espectral</td></tr><tr><td>Solução de metanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>#179957</td><td>Fixação de células</td></tr><tr><td>P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] anticorpo</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#2846</td><td>Anticorpo acoplado ao Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] anticorpo</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#13148</td><td>Anticorpo acoplado ao Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>anticorpo p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8]</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#9468</td><td>Anticorpo acoplado com Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>anticorpo p-STAT5 (Tyr694) [D47E7]</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#14603</td><td>Anticorpo acoplado a PE</td></tr><tr><td>Controle de IgG de coelho [DA1E]</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#2975</td><td>Anticorpo acoplado ao Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Controle de IgG de coelho [DA1E]</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#2985</td><td>Anticorpo acoplado ao Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Controle de IgG de coelho [DA1E]</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#8760</td><td>Anticorpo acoplado com Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>Controle de IgG de coelho [DA1E]</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>#5742S</td><td>Anticorpo acoplado a PE</td></tr><tr><td>Toalhetes higienizantes</td><td>Canadá Unido</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>Desinfecção para aspiração de medula óssea</td></tr></tbody></table>

citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

O projeto experimental visa monitorar o estado de fosforilação de proteínas selecionadas de interesse em diferentes momentos, por exemplo, 1 dia de início do pré-tratamento e 15 dias após o início do tratamento. Essa linha de base serve como um controle crítico para verificar a veracidade das alterações subsequentes na ativação da via de sinalização após o tratamento. Após quinze dias de tratamento, uma segunda comparação é realizada para avaliar a modulação da via em camundongos tratados versus controles tratados com veículo (Figura 4). Essa abordagem em duas etapas permite a distinção entre os efeitos induzidos pelo tratamento e a variabilidade basal.
Para este estudo, foi utilizado um modelo de camundongo AML PDX. Os camundongos foram transplantados com células LMA derivadas de pacientes caracterizadas pelas seguintes mutações: DNMT3AMR882H com uma fração alélica variante (VAF) de 48%, NPM1W288fs VAF 36%, FLT3ITD VAF 10% e IDH2R140Q VAF 44%. Após o transplante, foram permitidas três semanas para o crescimento do tumor antes de iniciar o tratamento. Os camundongos PDX transplantados com mutante FLT3 foram tratados por quinze dias com um dos três regimes: placebo, gilteritinibe (15 mg / kg por dia) ou uma combinação de venetoclax (50 mg / kg por dia), 5-azacitidina (2,5 mg / kg por dia) e cedarizudina (3 mg / kg por dia) (Figura 4A).
Com relação aos resultados obtidos, vale ressaltar que o tratamento com esquema à base de venetoclax resultou em fosforilação significativamente aumentada de STAT5 e RPS6, sugerindo que essas vias contribuem para a resistência à terapia (Figura 4E). Em contraste, o gilteritinibe, um medicamento direcionado ao FLT3, não reduziu o status de fosforilação dos efetores FLT3 mutantes. É possível que, na amostra de LMA testada, a presença de mutações secundárias adicionais além de FLT3-ITD (por exemplo, IDH2) contribua para a ativação dessas vias ou que o tratamento medicamentoso ao longo de duas semanas resulte na eliminação seletiva de células de LMA com diminuição da sinalização. Como todas as fosfoproteínas analisadas são da mesma população de células, é possível comparar a ativação da fosfoproteína. Neste experimento, a correlação mais forte na coloração de fosfoproteínas parece ser entre p-STAT5 e p-RPS6 (Figura Suplementar 1A), que são regulados positivamente neste grupo experimental após o tratamento (Figura 4E). Parece haver uma relação menor entre p-STAT5 e p-ERK (Figura Suplementar 1B). É importante ressaltar que o tamanho da célula (avaliado usando FSC-A) não é um dos principais contribuintes para a positividade geral do p-STAT5, destacando que a positividade da coloração não é apenas um produto do tamanho da célula (Figura Suplementar 1C). Essa estrutura experimental permite uma avaliação abrangente dos efeitos desses tratamentos na modulação da via de sinalização.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
Figura 1: Visualização das vias de sinalização do alvo e a estratégia para sua análise. (A) Visão geral das vias de sinalização envolvendo p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) e p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Na via p-STAT5, JAK sofre autofosforilação, aumentando sua atividade catalítica, depois fosforila resíduos específicos de tirosina, criando locais de ancoragem para proteínas STAT. O STAT5 fosforilado (Tyr694) homodimeriza e se transloca para o núcleo, onde se liga a elementos específicos responsivos ao STAT nas regiões promotoras dos genes-alvo. Na cascata RAS-RAF-MEK-ERK, a autofosforilação do receptor FLT3 ou de outros receptores tirosina quinases (RTKs) após a ligação do ligante leva à troca de GDP por GTP em RAS, ativando assim o RAS. O RAS-GTP ativado recruta RAF para a membrana plasmática, onde o RAF sofre uma mudança conformacional e se torna ativo. RAF então fosforila e ativa MEK1 / 2, uma quinase de dupla especificidade, que por sua vez fosforila ERK em resíduos Thr202 / Tyr204. O ERK1/2 ativado se transloca para o núcleo, onde fosforila fatores de transcrição específicos. ERK1/2 também é capaz, por meio de vias de sinalização intermediárias, de aumentar a atividade de mTORC1 e fosforilar eIF4E em locais específicos para aumentar a atividade de tradução. Ativado por nutrientes e fatores de crescimento através de FLT3 e outros RTKs, o mTORC1 fosforila alvos a jusante como S6K1 e 4E-BP1. S6K1, por sua vez, fosforila RPS6, o que aumenta a função do ribossomo e ativa a tradução. A hiperfosforilação de 4E-BP1 libera eIF4E, permitindo a montagem do complexo de iniciação da tradução eIF4F e a ativação da tradução dependente de cap. Todas essas vias estão altamente envolvidas na LMA, contribuindo para adaptações adquiridas, aumentando a proliferação celular, o metabolismo e a resistência a sinais apoptóticos. (B) apresenta as principais etapas do protocolo acoplado de aspiração de medula óssea e coloração de fosfofluxo intracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualização das etapas críticas durante o procedimento de aspiração da medula óssea. A área cirúrgica e os materiais necessários são montados sob uma capela de fluxo laminar. Após a anestesia por inalação de isoflurano (A), a superfície articular femoral é preparada para aspiração (B,C). O osso femoral é puncionado por uma primeira seringa alinhada ao meio do osso femoral (D). É fundamental evitar a aplicação de forte pressão na agulha e, em vez disso, realizar um movimento de perfuração rotativa; Isso geralmente é suficiente para que a agulha perfure a superfície do osso e siga o caminho da cavidade femoral. Em seguida, a medula óssea é aspirada com uma segunda seringa através do local da punção (I,J). Após a transferência do aspirado de medula óssea para um tubo de microcentrífuga (K), uma leve pressão é aplicada para estancar o sangramento na área (L) e o camundongo é colocado em uma gaiola quente e limpa para recuperação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
Figura 3: Fluxo de trabalho para a análise da estratégia de gating, incluindo controles de isotipo. (A) representa estratégias de gating para células vivas, exclusão de dupletos e células AML positivas para hCD45. (B) mostra sinais para cada fosfoproteína em marrom e controles de isotipo em preto (duas réplicas biológicas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
Figura 4: Fluxo de trabalho para a detecção e análise de fosfoproteínas intracelulares após imuno-estanquinação de células viáveis de LMA da medula óssea. (A) Camundongos NSG-SGM3 enxertados com células AML doadas por pacientes foram tratados com veículo (controle) ou venetoclax, 5-azacitidina e cedazuridina (vene / aza / CDZ) ou gilteritinibe. Após 15 dias, os aspirados de medula óssea (MO) foram processados. (B) representa a estratégia de gating para a análise de células LMA viáveis (por exemplo, hCD45/Zombie-NIR positivo) 15 dias após o tratamento. (C,D) representam a normalização do sinal para cada um dos fosfoanticorpos, conforme indicado, em 10.000 células AML isoladas de camundongos tratados com venetoclax/5-azacitidina/cedazuridina ou veículo (B) ou gilteritinibe ou veículo (C). Os traços representam os sinais em células AML isoladas do camundongo controle tratado com veículo (azul claro), vene/aza/CDZ (vermelho) ou gilteritinibe (roxo). (E) O histograma representa as mudanças médias nas intensidades de coloração para cada fosfoproteína testada em células vivas AML CD45+ humanas de três camundongos e SD. As barras de erro representam o desvio padrão. Os asteriscos indicam diferenças significativas nas intensidades de coloração avaliadas por ANOVA com valores de p abaixo de 0,05 (*) e 0,01 (**). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-STAT5 (Tyr694)</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204)</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle de IgG de coelho</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle de IgG de coelho</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle de IgG de coelho</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle de IgG de coelho</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista de diluições otimizadas para anticorpos.
Figura suplementar 1: Comparação de p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 e FSC-A em uma amostra representativa de AML PDX. Esta figura mostra um exemplo da relação entre p-STAT5, p-ERK e p-RPS6 em camundongo "E9" no dia 15 de tratamento com venetoclax / 5-azacitidina / cedazuridina (resultado da Figura 4C). Nesta amostra, a correlação mais forte na coloração de fosfoproteínas parece ser entre p-STAT5 e p-RPS6 (A), que são regulados positivamente neste grupo experimental após o tratamento (Figura 4E). Parece haver uma relação menor entre p-STAT5 e p-ERK (B). É importante ressaltar que o tamanho da célula (avaliado usando FSC-A) não é um dos principais contribuintes para a positividade geral do p-STAT5, destacando que a positividade da coloração não é apenas um produto do tamanho da célula (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

Nossa pesquisa visa entender como a leucemia mieloide aguda desenvolve resistência às terapias aprovadas. Com base na hipótese de que o metabolismo desempenha um papel fundamental. O objetivo final é identificar uma estratégia que possa efetivamente superar essa resistência. A citometria de fluxo, amplamente utilizada na pesquisa de leucemia, é ideal para analisar células em suspensão como células leucêmicas. Sua adaptabilidade o torna uma ferramenta poderosa para o mecanismo molecular de dados. O principal desafio experimental na pesquisa de LMA é desenvolver um protocolo in vivo ideal para o renascimento molecular, que é a célula para modelagem precisa, entendendo o mecanismo subjacente à resistência terapêutica.[Narrador] Para começar, dobre o joelho do mouse e use a mão não dominante para imobilizar a perna a fim de expor a superfície articular do fêmur onde está localizado o lado da punção. Coloque o polegar na tíbia, o dedo indicador no fêmur e o dedo médio no lado externo dos ossos para estabilizá-los. Enquanto mantém a imobilização, desinfete a área do joelho com álcool isopropílico para afastar os pelos restantes e melhorar a visualização da estrutura óssea. Usando a primeira seringa seca de calibre 25, posicione a agulha no meio da articulação do fêmur e gire-a suavemente para criar um orifício na superfície articular femoral sem aplicar força. Assim que a agulha entrar na medula, retire gradualmente a seringa enquanto a gira. Insira a segunda seringa lavada no orifício criado pela primeira agulha. Aplique vácuo na segunda seringa inserida no fêmur enquanto gira suavemente e retira gradualmente. Transfira a medula óssea extraída lavando o conteúdo da seringa em um tubo de microcentrífuga resfriado contendo 500 microlitros de PBS. Mantenha a amostra no gelo. Aplique uma leve pressão no local da punção usando um cotonete de isopropanol por 30 segundos para estancar qualquer sangramento. Centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando um sistema de aspiração a vácuo, aspire suavemente e descarte o sobrenadante. Adicione 200 microlitros por amostra de solução de coloração de células fluorescentes. Diluído de um a 100 em PBS para rotular as células mortas. Ressuspenda suavemente as células com uma pipeta. Em seguida, incube as células no gelo por 10 minutos, protegidas da luz. Após 10 minutos, centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante usando um sistema de vácuo, adicione 100 microlitros por amostra de anticorpo ultravioleta brilhante HCD 45 395 diluído de um a 100 em PBS contendo 2% de soro fetal bovino para marcar células hematopoiéticas humanas. Incube as células no gelo por 15 minutos, garantindo que estejam protegidas da luz. Centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo. Ressuspenda o pellet em um mililitro de formaldeído a 1,6% em solução de PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, protegido da luz. Após 10 minutos, centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo. Agora adicione um mililitro de metanol 100%, pré-resfriado a menos 20 graus Celsius diretamente nos dois. Incubar as amostras a menos 20 graus Celsius por 30 minutos protegidas da luz. Centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando um sistema de vácuo, aspire e descarte o sobrenadante. Adicione 50 microlitros de solução mista de anticorpos ou solução mista de controle de isotipo a cada amostra. Ressuspenda suavemente as células usando uma pipeta, incube todas as amostras durante a noite a quatro graus Celsius, garantindo que estejam protegidas da luz. Em seguida, centrifugue as células a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, lave as células com 1000 microlitros de PBS, ressuspendendo-as suavemente com uma pipeta. Centrifugue as células novamente a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, faça uma segunda lavagem usando 1000 microlitros de PBS e ressuspenda suavemente as células com uma pipeta antes de centrifugar as células novamente a quatro graus Celsius. Após a aspiração, o sobrenadante ressuspende as amostras finais em 200 microlitros de PBS. Esta figura ilustra o fluxo de trabalho, a estratégia de gating e a normalização dos sinais de fosfoproteína intracelular em células da medula óssea de camundongos xenoenxertos derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda tratados com terapia baseada em venetoclax por 15 dias. A estratégia de gating identificou com sucesso células viáveis de leucemia mieloide aguda humana ou LMA com base em perfis de dispersão direta e lateral e positividade de CD45, permitindo uma análise consistente em todos os grupos de tratamento. O tratamento com venetoclax 5-azacitidina e uridina CDZ levou ao aumento da fosforilação de STAT5 e RPS6 em células AML, sugerindo ativação de vias de sobrevivência associadas à resistência. Curiosamente, quando os camundongos foram tratados com Gilteritinibe, o tratamento não reduziu significativamente a fosforilação das proteínas da via FLT3, indicando que a sinalização persistiu apesar da terapia direcionada. O STAT5 fosforilado e o RPS6 fosforilado mostraram o maior aumento na correlação nos níveis de expressão após a terapia baseada em venetoclax, indicando a coativação dessas vias.

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Biologia

Este vídeo demonstra a avaliação da fosforilação intracelular de proteínas induzida por citocinas estromais em células leucêmicas. Essas proteínas fosforiladas intracelulares são quantificadas usando a técnica de citometria de fosfofluxo.

Avaliação da fosforilação de proteínas intracelulares induzida por citocinas estromais usando citometria de fluxo fosfométrica

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Usamos a coloração de proliferação celular para identificar células quiescentes no modelo de leucemia linfoblástica aguda T de peixe-zebra. A coloração é retida em células que não se dividem e reduzida durante a proliferação celular, permitindo a seleção de células dormentes para interrogação posterior. Este protocolo fornece uma ferramenta funcional para estudar a auto-renovação no contexto da quiescência celular.

Identificação de células quiescentes em um modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de peixe-zebra usando coloração de proliferação celular 

Este protocolo fornece instruções passo a passo para gerar e solucionar problemas de xenoenxertos de leucemia linfoblástica aguda humana (LLA) de linhagens celulares e material fresco do paciente em embriões de peixe-zebra imunossuprimidos transitoriamente, juntamente com diretrizes para avaliação de resposta a medicamentos usando citometria de fluxo. O pipeline experimental também pode ser adaptado para tumores sólidos.

Predição rápida de resposta a medicamentos in vivo usando enxertos de células de leucemia em embriões de peixe-zebra

Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.

In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Aprenda citometria de fosfofluxo para analisar vias de sinalização mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide aguda xenotransplantadas. Este método avançado auxilia no desenvolvimento de terapias direcionadas.

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

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