Name: In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a cultivar células T específicas para H5N1 em patos e detectar IFN-γ por coloração intracelular de citocinas. Este protocolo padronizado permite estudar respostas imunes aviárias e desenvolver ferramentas para vacinas.

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<ol><li>Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+T+cell+activation+and+lineage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation.</a> Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).</li>
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<li>Faulkner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+in+vitro+culture+methods+to+characterize+primary+T-cell+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs.</a> Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).</li>
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<li>Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interferon-gamma+%28IFN-%CE%B3%29+and+IFN-%CE%B3+receptor+1%2F2+%28IFN%CE%B3R1%2F2%29+in+regulation+of+immunity%2C+infection%2C+and+cancer+development%3A+IFN-%CE%B3-dependent+or+independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway.</a> Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).</li>
<li>Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Artifact+in+Intracellular+Cytokine+Staining+for+Studying+T+Cell+Responses+and+Its+Alleviation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation.</a> Front Immunol. 13, 759188(2022).</li>
<li>Yu, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+assays+show+human+gamma-delta+T+cells+specific+for+common+allergens+are+Th1-polarized+in+allergic+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors.</a> Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de MICRO-Centrífuga de 1,5 mL</td><td>Biosharp</td><td>Cat#BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 48 poços (não tratado, fundo plano)</td><td>Biofil</td><td>Cat#TCP000048</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>Placas qPCR sem rodapé de 96 poços</td><td>Labselect</td><td>Cat#PP-96-NS-0100</td><td></td></tr><tr><td>BD Kit Cytofix/Cytoperm BD</td><td>Bioscience</td><td>Cat#BD 554714</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#347688</td> Incubadora de CO2 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>Heracell 150i GP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit de rotulagem Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Abcam</td><td>Cat#ab113853</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Cat#Q341-02</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de linfócitos do sangue periférico de pato</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#LTS1090D</td><td></td></tr><tr><td>Evo M-MLV RT Premix</td><td>Biotecnologia Precisa</td><td>Cat#AG11706</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Isolamento Total de RNA de Células/Tecidos Kit V2</td><td>Vazyme</td><td>Cat#RC112-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>Cat#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Beckman Coulter</td><td>BA43347</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Fluxo</td><td>Beyotime</td><td>Cat#FFC005</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>Tree Star</td><td>https://www.flowjo.com</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse 488, diluição 1:50</td><td>Abbkine</td><td>Cat#A23210</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b Anti-Rato de Cabra, FITC, diluição 1:50</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat#1091-31</td><td></td></tr><tr><td>IgG3 Anti-Rato de Cabra, PE, diluição 1:250</td><td>Southern Biotech&nbsp;</td><td>Cat#1100-09S</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad prisma 8.0.2</td><td>Software GraphPad</td><td>https://www.graphpad-prism.cn</td><td></td></tr><tr><td>H5N1 AIV cepa DK383</td><td>Laboratório de Engenharia Conjunta Nacional e Regional para Medicamen de Prevenção e Controle de Zoonoses</td><td>A/Duck/Guangdong/383/2008</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Motic</td><td>AE2000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Duck CD4, diluição 1:50</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#MCA2478</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Duck CD8&alpha;, diluição 1:50</td><td>GeneTex&nbsp;</td><td>Cat#GTX41834</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Duck IFN-&gamma; mAb, diluição 1:10</td><td>Preparado em nosso laboratório&nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher</td><td>AZY1603209</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (não essencial</td><td>Gibco</td><td>Cat#11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>Cat#10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR Termociclador</td><td>Biometra</td><td>Biometra Tone 96G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7500</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante (10 &mu; g)</td> <td>USCNK</td><td>Cat#RPA111Ga01</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#NH4CL2009</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat#11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#93595</td><td></td></tr><tr><td>Patos selvagens de duas semanas (Sheldrake)</td><td>uma fazenda de patos em Guangzhou</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro cultura para células t de pato específicas para h5n1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares

In Vitro Culture for H5N1-Specific Duck T Cells and Detection of Immune Responses Using Intracellular Cytokine Staining Method

Este protocolo foi desenvolvido com base em um estudo anterior sobre a detecção de respostas efetoras de células T específicas do antígeno em patos20. A primeira etapa do experimento envolve o cultivo in vitro de células T específicas do vírus, que servem como base para estudos subsequentes de resposta efetora. Inicialmente, as APCs foram incubadas e co-cultivadas com células efetoras. As observações morfológicas revelaram que, após a proliferação, as células exibiram crescimento de clust...

In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares

The in vitro culture of T cells is a critical method for studying immune responses, viral infections, and potential therapeutic strategies. However, no ...

in-vitro-culture-for-h5n1-specific-duck-t-cells-detection-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Ao contrário de partículas de HIV-1 livre de células, as células T CD4 + infectadas são eficazmente detectada pelas células dendríticas plasmocitoides (PDCs). Este manuscrito descreve um método em que as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou pDCs isoladas são co-cultivadas com o HIV-1 de células T infectadas para avaliar a detecção inata por pDCs como avaliada por libertação de IFN tipo I.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia&gt; 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

Dois métodos baseados em citometria de fluxo - um ensaio de priming de células T in vitro e coloração de citocinas intracelulares foram utilizados para medir a capacidade de apresentação de antígenos de células dendríticas e respostas de células T específicas do antígeno a uma infecção mutante pelo vírus do Nilo Ocidental em camundongos.

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.

Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório

Aqui descrevemos um protocolo para empacotamento de pseudovírus e a medição da atividade neutralizante de anticorpos.

Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

Aprenda a cultivar células T específicas para H5N1 em patos e detectar IFN-γ por coloração intracelular de citocinas. Este protocolo padronizado permite estudar respostas imunes aviárias e desenvolver ferramentas para vacinas.

In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares (Vídeo) | JoVE Journal

In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares

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