Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de plataformas de alto rendimento e suportadas por andaimes para culturas orgonômicas robustas, reprodutíveis e derivadas de pacientes para melhorar o fluxo de trabalho do ensaio de triagem de medicamentos e ajudar na modelagem avançada de doenças.

Manipuladores automatizados de líquidos, plataformas de hidrogel suportadas por andaimes, tecnologias de órgão em chip e ensaios de célula única, como citometria de fluxo e CYTOPs, são algumas das tecnologias disponíveis atualmente.

Os desafios atuais incluem preservar a integridade do hidrogel, superar o menisco em gel para imagens em tempo real e garantir a distribuição celular uniforme em ensaios baseados em organoides de longo prazo.

Nosso protocolo permite o carregamento consistente de hidrogel suportado por andaimes, minimiza os problemas de menisco, suporta a cultura organoide de longo prazo e se integra perfeitamente com manipuladores automatizados de líquidos e sistema de imagem de alto conteúdo.

Estamos muito entusiasmados com o uso de nossas plataformas de modelagem de doenças para explorar os mecanismos de progressão da doença no câncer e no desenvolvimento da obesidade.

[Instrutor] Para começar, pegue um andaime de padrão PMMA para 96 ou 384 SPOT. Apare o excesso de papel ao redor da região azul do andaime, deixando uma margem branca de cinco milímetros ao redor do perímetro. Certifique-se de que a folha resultante meça aproximadamente 760 milímetros por 1.300 milímetros. Para preparar um andaime 96 SPOT para montagem, coloque um pedaço de filme de polietileno sobre um suporte acrílico rígido. Coloque este suporte coberto por filme na superfície de trabalho e coloque o andaime em cima do filme de polietileno. Alinhe a borda de uma régua entre as duas primeiras fileiras do andaime para evitar traçar os poços. Coloque a roda de rastreamento na parte inferior do andaime e role-a para cima até o topo, guiada pela régua. Para um andaime 384 SPOT, não execute perfuração. Em seguida, coloque o andaime com o lado áspero voltado para cima em uma laje PDMS, garantindo que as linhas funcionem horizontalmente. Use a linha de escorva para determinar qual lado é áspero e, em seguida, alise o andaime na laje para remover rugas ou bolhas. Remova a camada protetora do lado não gravado da fita dupla face. Aperte levemente a fita no meio e alinhe as duas colunas do meio da fita com o andaime. Agora, pressione o meio da fita no andaime para garantir o alinhamento. Alise a fita para fora do centro para fixá-la uniformemente. Usando uma pinça, levante suavemente o andaime da laje PDMS. Armazene a laje para uso futuro. Para prender o andaime à segunda fita de poço, vire o andaime de forma que o lado liso e não colado fique voltado para cima na bancada. Remova a camada protetora intermediária do lado gravado da segunda fita para expor duas colunas centrais. Aperte levemente o meio da segunda fita e alinhe-a com as colunas do meio do andaime e, em seguida, pressione o centro da fita para fixá-la no lugar. Se for usada fita adesiva, remova as camadas protetoras restantes adjacentes ao centro exposto. Alise a fita, começando do meio e movendo-se para fora. Para prender o andaime à placa sem fundo, remova a camada protetora. Alinhe o andaime sob a placa sem fundo com uma tampa. Uma vez alinhado, pressione o meio na placa. Se estiver usando fita gravada, remova as camadas adjacentes e alise o andaime na placa para fora do centro. Para prender o andaime ao filme de policarbonato, use uma pinça para soltar cuidadosamente a camada protetora de um lado do filme de policarbonato e, em seguida, retire lentamente a camada protetora sem causar reentrâncias no filme. Repita o processo para o segundo lado e coloque o filme de lado na bancada. Retire a camada de fita protetora do fundo da placa e pressione o filme de policarbonato no andaime do centro para fora. Em seguida, pressione firmemente o filme de policarbonato no andaime para garantir que cada poço tenha uma borda definida. Usando uma faca de precisão, corte cuidadosamente o excesso de material do fundo da placa. Após a montagem completa, coloque a placa 96 SPOT em um saco plástico transparente e que possa ser fechado novamente e leve-a para fora do gabinete de biossegurança. Coloque um suporte de acrílico rígido embaixo da placa e prenda ambos em cantos opostos. Guarde a placa em um local limpo e seco até o uso posterior. Nenhum vazamento ou troca de mídia foi observado quando os poços alternados na placa 384 SPOT foram preenchidos com fluoresceína e PBS durante um período de teste de 30 dias, confirmando a eficácia da barreira de PMMA na manutenção do isolamento poço a poço. Os organoides tumorais pancreáticos que expressam GFP semeados em 96 placas SPOT permaneceram viáveis e se expandiram progressivamente do dia zero ao dia 12 da cultura. No dia 12, os organoides cultivados em SPOT exibiram forte expressão de citoqueratina 19 e Zonula Occludens-1, juntamente com a presença de estruturas internas de lúmen. Os resultados de semeadura de tecido abaixo do ideal e ideal em 384 placas SPOT foram visualmente distinguíveis pela definição da borda e uniformidade da distribuição celular. A semeadura consistentemente uniforme foi alcançada em todas as 96 placas SPOT e 384 SPOT usando o manipulador automatizado de líquidos.