Name: Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a fabricar a plataforma SPOT para cultura de organoides em alta vazão usando andaimes de hidrogel. Este método automatizado melhora o rastreamento de drogas e a modelagem de doenças com reprodutibilidade.

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<ol><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture%3A+A+Breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo.</a> Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
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Apesar dos avanços na pesquisa biomédica, o desenvolvimento de ensaios in vitro fisiologicamente relevantes continua sendo um desafio. Um ensaio ideal deve acomodar uma gama diversificada de tipos de células, formulações de tratamento, escalas de tempo, instrumentação comercial e leituras analíticas para atender às necessidades de pesquisadores em várias disciplinas. No entanto, devido à falta de ferramentas adequadas, os pesquisadores muitas vezes contam com modelos simplistas, como monocamadas 2D de linhagens celulares imortalizadas, que não conseguem recapitular a complexidade e a relevância clínica, particularmente na pesquisa do câncer 1,2. Para resolver isso, o biobanco de tumores em larga escala e a colaboração de médicos impulsionaram o desenvolvimento de modelos in vitro de alta fidelidade, como organoides tumorais derivados de pacientes (PDOs), que retêm mais perfis genéticos e terapêuticos específicos do paciente em comparação com as linhagens celulares 3,4,5. Enquanto isso, os avanços na automação laboratorial e na descoberta de medicamentos exigem plataformas que se integram perfeitamente a fluxos de trabalho de alto rendimento. Embora as plataformas existentes abordem a fidelidade biológica ou a escalabilidade, poucas foram capazes de resolver os dois desafios simultaneamente 6,7,8. O desenvolvimento de modelos automatizados e de alto rendimento que repliquem as principais características da doença é crucial para o avanço da pesquisa biomédica e a aceleração da geração de dados para aplicações translacionais.
Numerosos modelos emergentes visam enfrentar os desafios associados à cultura de tipos de células especializadas, como PDOs, com alto rendimento (Figura 1). As plataformas padrão, onde os organoides são misturados com hidrogel em placas de 96 ou 384 poços, apresentam várias limitações: (i) o alto volume de células e gel leva ao acesso inconsistente a nutrientes, (ii) a curvatura do menisco do poço cria artefatos de imagem e gradientes celulares, (iii) a semeadura de hidrogel carece de uniformidade entre lotes e pessoal, (iv) incompatibilidade com fabricação automatizada e microscopia automatizada e (v) o uso de matriz extracelular (ECM) que normalmente é uma amostra de risco macia e frágil destruição em densidades fisiológicas de tecidos ou incorporação de tipos de células contráteis 1,9. Atualmente, a maioria dos estudos de PDO baseados em placas é conduzida semeando manualmente o gel celular na placa10,11 ou um método de sobreposição de gel, onde o hidrogel é diluído com um meio menos viscoso e as células são centrifugadas no fundo do poço para colocá-las no plano óptico apropriado12,13. Ambas as abordagens falham em fornecer suporte mecânico para a cultura de longo prazo. Com base em nossas observações anteriores (dados não publicados), o hidrogel comercial misturado com células em placas de poços padrão se contrai das superfícies do poço por 9 dos 12 poços ao longo de 12 dias, enquanto o método de sobreposição de gel carece de interações fisiológicas célula-matriz. Além disso, as culturas resultantes não podem ser mantidas por longos períodos devido a limitações de espaço dentro do poço e são incompatíveis com ensaios que requerem uma alta proporção de reagente para meio celular 14,15,16. Essas barreiras práticas dificultam a adoção de modelos 3D e limitam a reprodutibilidade experimental em todo o campo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig1.jpg"> 
Figura 1: Avaliação de modelos de cultura com base na escalabilidade e relevância biológica. O posicionamento relativo de vários sistemas de cultura in vitro e in vivo ao longo da escalabilidade (eixo y), definida pelo rendimento da placa, e relevância biológica (eixo x), destacando os trade-offs entre o potencial de rendimento e a fidelidade fisiológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Motivados por esses desafios, a alta porosidade e o reforço mecânico de um andaime fino de celulose foram aproveitados para desenvolver a Plataforma Suportada por Andaimes para Tecidos à Base de Organoides (SPOT), disponível nos formatos de 96 e 384 poços. O SPOT incorpora um andaime pré-padronizado de polímero usando um método de infiltração desenvolvido anteriormente17 que corresponde ao layout da placa, permitindo a colocação precisa de gotículas de célula-gel e fornecendo suporte estrutural para a fase de hidrogel (Figura 2A). A absorção capilar no andaime guia a solução célula-gel, formando uma rede de biocompósitos reforçada mecanicamente (Figura 2B). Devido à estrutura porosa do andaime, o gel celular se infiltra e forma uma camada fina (aproximadamente 70 μm de espessura), exigindo dez vezes menos quantidade de gel celular para cobrir o fundo do poço14. A compatibilidade do SPOT com PDOs de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) também foi demonstrada avaliando seu crescimento usando ensaios metabólicos e medições baseadas em imagens. Desde o seu desenvolvimento, o SPOT demonstrou versatilidade e usabilidade significativas para pesquisadores envolvidos na cultura de organoides. Além disso, o design do SPOT acomoda escalabilidade amigável, com volumes reduzidos de reagentes e recursos de imagem aprimorados por meio de sua geometria de microgel plana e sem menisco, garantindo penetração uniforme de luz e imagens precisas de alto conteúdo14 (Figura 2C, D). O SPOT também suporta co-cultura com outros tipos de células relevantes, como fibroblastos, para recapitular melhor o microambiente tumoral18.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig2.jpg"> 
Figura 2: Visão geral do dispositivo 96-SPOT e fluxo de trabalho de análise de imagem. (A) Representação esquemática da fabricação da placa SPOT: o dispositivo é montado agrupando uma placa de poço comercial sem fundo (superior), andaime com padrão de PMMA (mostrado em azul) e filme de policarbonato (abaixo) usando camadas de adesivo poliacrílico de dupla face (mostrado em amarelo). (B) Semeadura de células no poço de andaime: as células são suspensas em um hidrogel não polimerizado (mostrado em rosa) e pipetadas em cada poço onde se infiltram no andaime. O hidrogel é então deixado gelificar para encapsular as células dentro do hidrogel suportado por andaime. (C) Microscopia: o microtecido resultante pode ser visualizado usando microscopia automatizada de campo amplo. (D) Análise baseada em imagem: Imagens adquiridas de células fluorescentes (verde) suspensas em gel podem ser analisadas usando pipelines de análise de imagem padrão. Imagem de microscopia de epifluorescência representativa de células KP4 que expressam GFP em um poço de 96 SPOT. A barra de escala é de 500 μm. Este número foi modificado de14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Outra vantagem do SPOT é que o sistema pode ser integrado a um manipulador de líquidos de código aberto, facilitando a fabricação automatizada e reprodutível de culturas de DOP. Esse avanço reduz a variabilidade do usuário e oferece suporte a projetos experimentais complexos, incluindo triagem de medicamentos de alto rendimento e abordagens de medicina personalizada18. O SPOT também demonstrou ser compatível com a caracterização multiplexada baseada em célula única de fenótipos celulares em ambientes tumorais heterogêneos e a recuperação das células sob demanda do SPOT por digestão18. Esses recursos posicionam o SPOT como uma ferramenta versátil para aplicações de triagem, onde dados longitudinais de alta resolução são essenciais para avaliar a eficácia do medicamento e o comportamento celular em condições fisiologicamente relevantes14,18. Ao combinar essas inovações técnicas, o SPOT aborda limitações críticas nos sistemas tradicionais de cultura 3D.
Este protocolo fornece um guia abrangente para a fabricação de componentes SPOT, placas de montagem e métodos de semeadura para culturas organoides 3D robustas e reprodutíveis. Inclui instruções detalhadas para semeadura manual de placas usando uma micropipeta e fluxos de trabalho de semeadura automatizados com um manipulador de líquidos, que suporta formatos de 96 e 384 poços. Além disso, este protocolo descreve medidas essenciais de controle de qualidade, como verificar a distribuição uniforme do gel e a integridade do andaime, para manter altos padrões experimentais. Estratégias de solução de problemas também são fornecidas para resolver problemas comuns, como infiltração incompleta de gel, evaporação durante a semeadura e desprendimento de andaimes, equipando os pesquisadores com soluções práticas para otimizar seus fluxos de trabalho e obter resultados confiáveis.
O SPOT foi projetado para preencher as lacunas que os ensaios organoides tradicionais enfrentam, incluindo desafios relacionados à realização de ensaios e mudanças de meio, preservando a integridade do gel 10,11,12,13. O objetivo geral deste método é fabricar uma plataforma suportada por andaimes que suporte a cultura de organoides por um período de 12 dias. Além disso, este método também abrange a geração de matrizes de tecidos no SPOT por meio de semeadura manual ou assistida por manipulador de líquidos para permitir que os usuários realizem qualquer perturbação a jusante, incluindo ensaios de IC50 de drogas e triagem de moléculas pequenas.

<table><tbody><tr><td>Tubos PCR de 0,2mL (tiras de 8)&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>FroggaBio</td><td>LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>1000-&mu; L ponteiras de pipeta</td><td>Eclipse</td><td>4-1019-260-000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 10 mL</td><td>FroggaBio</td><td>394010</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD, Canadá</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10x Meio essencial mínimo (MEM 10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 150 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras dispensadoras de calibre 16 com conexão Luer lock</td><td>McMaster-Carr, Illinois, EUA</td><td>Nº 6699A2</td><td></td></tr><tr><td>20&micro; L racks de pontas de filtro</td><td>Opentrons</td><td>999-00099</td><td></td></tr><tr><td>200&micro; L racks de pontas de filtro</td><td>Opentrons</td><td>999-00081</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L ponteiras de pipeta</td><td>Eclipse</td><td>4-1030-260-000</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de distribuição de calibre 20 com conexão Luer lock</td><td>McMaster-Carr, Illinois, EUA</td><td>Nº 6699A4</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poço sem fundo de 384 poços (preta)</td><td>Greiner</td><td>82051-544</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL&nbsp;</td><td>BD, Canadá</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de polipropileno de 50 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de polipropileno de 50 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poço sem fundo de 96 poços (preta)</td><td>Greiner</td><td>82050-714</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Científico</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Extensão AxiDraw para Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>API Python do AxiDraw (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de Escrita e Desenho Pessoal de Alto Desempenho AxiDraw V3</td><td>Cientistas Loucos do Mal, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno bovino (PureCol 3 mg/ml)</td><td>BioMatrix Avançado</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Linhagem celular de escolha</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cavalete de clipe (incluído no pacote AxiDraw V3)</td><td>Cientistas Loucos do Mal, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura de escolha</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fita de proteção contra retenção de sujeira</td><td>3M</td><td>6851 PN36851</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva poliacrílica dupla face (800 mm x 1200 mm)</td><td>Pesquisa de adesivos, ARcare</td><td>90106NB</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de chá Finum XL&nbsp;</td><td>Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburgo, Alemanha</td><td>420.69.00</td><td></td></tr><tr><td>Tampas planas para tubos de PCR de 0,2 mL (tiras de 8)</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td></td></tr><tr><td>Grampos de mola de plástico para serviço pesado</td><td>PONTO DE REFERÊNCIA</td><td>1024-554</td><td></td></tr><tr><td>Módulo HEPA - Modelo 110-130V 60Hz</td><td>Opentrons</td><td>999-00109</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de gelo (congelada, 1400 mm x 1800 mm)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software Inkscape</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cortador a laser</td><td>Sistema de laser universal</td><td>VLS3.75</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de acetato de etil vinil (EVA) em miniatura de diâmetro externo de 0,07 polegadas</td><td>McMaster-Carr, Illinois, EUA</td><td>1883T3</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica multicanal P20 (Gen2)</td><td>Opentrons</td><td>999-00005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica multicanal P300 (Gen2)</td><td>Opentrons</td><td>999-00006</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>Sally Hansen</td><td>SBS-006861</td><td>Opcional, para pigmentação de tinta PMMA</td></tr><tr><td>Opentrons OT-2</td><td>Opentrons</td><td>999-00111</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200 de 8 canais</td><td>Gilson</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilme</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>52859-079</td><td></td></tr><tr><td>Papel pergaminho&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pág. 4333</td><td></td></tr><tr><td>Poli (metacrilato de metila) (PMMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182230</td><td></td></tr><tr><td>Filme de policarbonato (760 mm x 1300 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K102</td><td></td></tr><tr><td>Monómero de polidimetilsiloxano e reticulador (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)</td><td>Adesivos Ellsworth</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Faca de precisão</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Suporte acrílico rígido (tamanho instalado no fundo da placa do poço)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de papelão rígido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Régua</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (0,8M em água destilada)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de temperatura com blocos de alumínio (Gen2)</td><td>Opentrons</td><td>999-00097</td><td></td></tr><tr><td>Roda de rastreamento&nbsp;</td><td>HEEPDD (Amazon)</td><td>B07YQWB284</td><td></td></tr><tr><td>Fita transparente&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação reprodutível de spot como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

Reproducible Manufacturing of SPOT as a High-throughput Scaffold-based Culture Platform

O padrão PMMA do andaime de papel serve como uma barreira física para evitar a troca de conteúdo entre os poços. Esse projeto é fundamental para garantir que os poços adjacentes permaneçam química e biologicamente isolados, evitando a difusão não intencional de meios, drogas, fatores secretados ou mesmo células14. A incorporação do PMMA permite uma compartimentalização precisa, tornando o SPOT uma plataforma confiável para triagem de alto rendimento e estudos de co-cultura, onde a contaminação cru...

Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

Patient-derived organoids (PDOs) are becoming increasingly used in the field of cancer research to model tumors. They combine the benefits of in vivo and ...

reproducible-manufacturing-spot-as-high-throughput-scaffold-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

No passado, muitos em sistemas de cultura in vitro - culturas, principalmente monocamada - muitas vezes sofreu com a desvantagem de que células diferenciadas primário teve um relativamente curto período de vida e de diferenciadas durante a cultura. Como conseqüência, a maioria de seus órgãos específicos funções foram perdidos rapidamente. Assim, a fim de reproduzir melhores condições para essas células in vitro, as modificações e adaptações foram feitas para as culturas convencionais monocamada.

Entrevista: biorreatores e apareceu-Modified 3D-andaimes para Investigação em Células Estaminais

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

Os protocolos descritos permitem que os laboratórios realizem cultura de células-tronco escaláveis e aderentes em alto rendimento com mão de obra, experiência e custo mínimo de investimento em equipamentos usando um robô programável de manuseio de líquidos e placas de 96 poços.  As iPSCs passadas mais de 20 vezes neste sistema mantiveram a pluripotência, cariótipos normais e se diferenciaram em cardiomiócitos.

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Este protocolo serve como um tutorial abrangente para a mistura padronizada e reprodutível de materiais viscosos com uma nova tecnologia de automação de código aberto. Instruções detalhadas são fornecidas sobre o funcionamento de uma estação de trabalho de código aberto recém-desenvolvida, o uso de um designer de protocolo de código aberto e a validação e verificação para identificar misturas reprodutíveis.

Uma plataforma de tecnologia de código aberto para fabricar modelos de cultura 3D à base de hidrogel de forma automatizada e padronizada

Tecidos cardíacos tridimensionais bioprojetados usando cardiomiócitos derivados de células-tronco têm emergido como modelos promissores para estudar o miocárdio humano saudável e doente in vitro , enquanto recapitulam aspectos-chave do nicho cardíaco nativo. Este manuscrito descreve um protocolo para fabricação e análise de tecidos cardíacos projetados de alto conteúdo gerados a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos.

Projetando um Biorreator para Melhorar a Aquisição de Dados e Modelar o Rendimento de Tecidos Cardíacos Projetados

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Aprenda a fabricar a plataforma SPOT para cultura de organoides em alta vazão usando andaimes de hidrogel. Este método automatizado melhora o rastreamento de drogas e a modelagem de doenças com reprodutibilidade.

Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

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