Name: Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a medir a ativação de proteínas G em células HEK293 vivas usando biossensores baseados em BRET. Este método permite monitorar sinalização de GPCRs em tempo real para estudos farmacológicos.

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<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs.</a> Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Advances+in+structures%2C+mechanisms%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">protein pathways.</a> Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).</li>
<li>Hepler, J. R., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">G proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).</li>
<li>Van Unen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+FRET+sensors+for+robust+measurement+of+G%CE%B1i1%2C+G%CE%B1i2+and+G%CE%B1i3+activation+kinetics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells.</a> PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2411 (2001).</li>
<li>Galés, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+activation-promoted+structural+rearrangements+in+preassembled+receptor-G+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).</li>
<li>Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+constitutive+G+protein-coupled+receptor+activity+with+BRET-based+G+protein+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors.</a> Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).</li>
<li>Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+GPCR+functional+assays+based+on+resonance+energy+transfer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).</li>
<li>Scott-Dennis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+membrane-based+Gi-CASE+biosensor+assay+for+profiling+compounds+at+cannabinoid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors.</a> Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).</li>
<li>Violin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+signaling+and+desensitization+elucidated+by+quantitative+modeling+of+real-time+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics.</a> J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).</li>
<li>Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+isoproterenol+modulation+of+beta-adrenergic+receptor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics.</a> Life Sci. 38, 309-315 (1985).</li>
<li>Thomas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+receptor+binding+analyses+of+cannabinoid+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists.</a> J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).</li>
<li>Schihada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+GPR35+have+distinct+extracellular+N-termini+that+allosterically+modify+receptor-transducer+coupling+and+mediate+intracellular+pathway+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias.</a> J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6664">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68463">10.3791/68463</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68463">BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

<table><tbody><tr><td>Placa avançada de cultura de 96 poços, branca com fundo plano transparente, com tampa, Greiner bio-one</td><td>Dutscher</td><td>655983</td><td></td></tr><tr><td>Filme Branco BrightMax ClearLine</td><td>Dutscher</td><td>760245</td><td></td></tr><tr><td>ClarioSTAR LVF</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DPBS Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, líquido, filtrado por estéril, adequado para células</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificado Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAX</td><td>Sigma</td><td>D0822</td><td>Quente em 37 graus e graus; Banho-maria C antes do uso</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Vênus</td><td>Addgene</td><td>168122</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ Presente de Gunnar Schulte</td></tr><tr><td>Galphas (isóforma curta)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-Vênus</td><td>Addgene</td><td>168124</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ Presente de Gunnar Schulte</td></tr><tr><td>HEK-293T expressando CB1R de forma estável (HEK CB1)</td><td></td><td></td><td>Gentil presente de M. Guzman (Universidade Complutense, Madri, Espanha)</td></tr><tr><td>HEK-293T tipo selvagem (HEK wt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>Solubilizado em H20 e armazenado em &ndash; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Suplemento Médio GlutaMAX</td><td>Fischer</td><td>11564506</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 Flag etiqueta beta-2-receptor adrenérgico FLAG C-ter</td><td></td><td></td><td>Generoso presente de D. Perrais (IINS, Bordeaux)</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-(vazio)-TAG</td><td>Addgene</td><td>138209</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solução de poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>RNBL7086</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>VITÓRIA - 55.212-2</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10009023</td><td>Solubilizado em DMSO e armazenado em &ndash; 20 & deg; C</td></tr></tbody></table>

biossensores de proteína g baseados em braket para medir a atividade do receptor acoplado à proteína g em células vivas

BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of transmembrane receptors, playing a crucial role in cellular signaling by transducing ...

bret-based-g-protein-biosensors-for-measuring-g-protein-coupled

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Métodos simples para detectar a ativação seletiva de proteínas G por receptores acoplados à proteína G continuam sendo um grande desafio na sinalização celular. Aqui, os biossensores de transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) foram desenvolvidos amarrando um GPCR a peptídeos de proteína G para sondar mudanças conformacionais em concentrações controladas em células vivas.

Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Dado que os GPCRs são alvos atraentes para drogados, a triagem de ligantes GPCR é, portanto, indispensável para a identificação de compostos de chumbo e para estudos de desordeiro. Para esses esforços, descrevemos o PRESTO-Tango, uma plataforma de recursos de código aberto usada para o perfil simultâneo de recrutamento transitório β-arrestin2 em aproximadamente 300 GPCRs usando um ensaio de repórter baseado em TEV.

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através da subfamília de receptores S1P (S1PRs). Aqui, um pipeline é descrito para expor sobre as estruturas e função das S1PRs.

Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ  na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

Aprenda a medir a ativação de proteínas G em células HEK293 vivas usando biossensores baseados em BRET. Este método permite monitorar sinalização de GPCRs em tempo real para estudos farmacológicos.

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

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