Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

Estamos desenvolvendo novos tipos de sondas de hibridização fluorescente para análise de ácido nucleico de sequência específica. Mais recentemente, as ferramentas de análise de hibridização se expandiram com ensaios que aproveitam os sistemas CRISPR-Cas. Atualmente, sondas de hibridização de última geração, como TaqMan, e sondas de farol molecular, são mais usadas para analisar alvos de ácidos nucleicos.

A detecção precisa de substituições de nucleotídeos únicos e alvos de ácidos nucleicos ainda é praticamente desafiadora. Nosso protocolo garante o nível necessário de atividade celular, ao mesmo tempo em que fornece uma leitura de sinal fluorescente sem rótulo. Para começar, projete as sequências de duas fitas de oligonucleotídeos de DNA não modificadas que constituem SLAS.

Use um fragmento contendo nucleotídeos para 6 a 39 de DAP-10-42. Converta a haste 1 consistindo de nucleotídeos 1 a 8 e 36 a 42 na haste 1 prime, removendo uma timina protuberante na posição 5, encurtando a haste para quatro pares de bases e adicionando um par de bases citosina-guanina terminal. Inclua os nucleotídeos 9 a 29 em uma fita SLAS e os nucleotídeos 30 a 35 na outra.

Estenda a sequência de três terminais primos do fragmento com os nucleotídeos 9 a 29 adicionando desoxi GGTCAT. Em seguida, estenda a sequência de cinco terminais primos do fragmento 30 a 35 com desoxi TGACC para formar uma haste 2 de seis pares de bases. Agora estenda a haste 1 prime em ambas as fitas com ligantes deoxy TT e sequências de DNA complementares ao alvo do ácido nucleico.

Isso produz as sequências de fitas SLAS-U e SLAS-S que constituem a sonda. Torne o SLAS-S complementar a uma região de 7 a 10 nucleotídeos. Isso inclui o local de substituição de nucleotídeo único.

Em seguida, certifique-se de que o braço de ligação alvo do SLAS-U seja complementar a um fragmento de 15 a 25 nucleotídeos adjacente à região SLAS-S. Avalie as temperaturas de fusão dos duplex de ligação de destino usando o servidor web UNAFold. Clique na guia INAMelt.

Vá para Aplicativos e selecione Hibridização de fusão de dois estados. Insira as sequências de interação em cinco a três primos nas caixas esquerda e direita. Em seguida, ajuste a temperatura do ensaio para 22 graus Celsius e insira as concentrações de cátions monovalentes e divalentes para 20 íons milimolares e 25 milimolares, respectivamente.

Ajuste as concentrações das sequências de interação na caixa correspondente. Pressione enviar e revise os valores de mudança de energia de Gibbs, enthalpY, entropia e temperatura de fusão para os duplex correspondentes. Confirme se as temperaturas de fusão para alvos perfeitamente combinados e os braços de ligação do alvo SLAS-S e SLAS-U estão acima da temperatura do ensaio, 22 graus Celsius.

Certifique-se de que o duplex entre SLAS-S e um alvo incompatível produza temperaturas de fusão abaixo da temperatura do ensaio para manter a especificidade. Se necessário, ajuste os comprimentos dos braços de ligação alvo para atender a essas condições. Obtenha as fitas de oligonucleotídeos SLAS-U e SLAS-S finalizadas de um fornecedor comercial de DNA ou sintetize-as internamente usando um sintetizador de DNA automatizado.

Prepare soluções de estoque de Auramina O, SLAS-S, SLAS-U e tampão de ensaio. Prepare a mistura principal contendo todos os componentes do ensaio, exceto o alvo. Adicione água livre de nuclease aos cinco por sexto volume final da mistura principal.

Em seguida, vórtice e gire a mistura master. Dispense 50 microlitros em cada tubo de amostra. Em seguida, rotule uma amostra como um branco sem alvo e outra como um controle positivo.

Adicione 10 microlitros de amostra contendo alvo a um tubo contendo a mistura principal para fazer uma amostra de 60 microlitros. Para o branco, adicione 10 microlitros de água livre de nuclease. Em seguida, pipetar 10 microlitros de oligonucleotídeo de DNA sintético contendo a sequência alvo no tubo de controle positivo.

Misturar brevemente todas as amostras na centrífuga utilizando uma microcentrífuga. Em seguida, incube os tubos a 22 graus Celsius por 10 a 60 minutos. Meça a fluorescência a 540 nanômetros após a excitação a 475 nanômetros usando um espectrofotômetro fluorescente.

O SLAS foi adaptado para atingir um fragmento específico do gene NANOGP8. O alvo M foi totalmente complementar à fita SLAS-S, enquanto o alvo MM teve uma posição de nucleotídeo de citosina 1, 423, introduzindo uma incompatibilidade com SLAS-S. Após a adição do alvo M totalmente complementar, a fluorescência aumentou de forma constante e se estabilizou após 45 a 50 minutos.

No entanto, um sinal claro foi detectável em 10 minutos com uma proporção sinal-branco de 10 SLAS mostrou alto sinal de fluorescência para alvos totalmente combinados, mas não para alvos incompatíveis ou brancos. A saída de fluorescência aumentou linearmente com concentração alvo de até 500 nanomolares, permitindo a quantificação e determinação dos limites de detecção. As amostras amplificadas por PCR mostraram níveis variados de sinal, com apenas a Amostra 2 excedendo o valor limite de fluorescência de 2.

Com base na curva de calibração, a concentração de amplicon NANOGP8 na Amostra 2 foi estimada em 124+ou 13 nanomolares. A detecção de fluorescência do sinal SLAS foi consistente em um espectrofotômetro de bancada e em um fluorômetro portátil. Uma relação sinal-branco acima de 20 também foi observada visualmente usando luz UV.