Name: Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a desenvolver sondas de hibridização dividida para análise de ácidos nucleicos com detecção específica de sequências. Este método utiliza o aptâmero fluorescente DAP-10-42 como repórter de sinal sem marcação.

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1. Projeto do Sensor de Iluminação Split (SLAS) com DAP-10-42 como repórter de sinal
<ol>
	<li>Projetar as sequências de duas fitas de oligonucleotídeos de DNA não modificadas que constituem SLAS. Use um fragmento contendo nucleotídeos (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tabela 1, Figura 1A).</li>
	<li>Converta a sequência da haste 1 (nts 1-8 e 36-42) para a haste 1 'removendo um resíduo de timina protuberante na posição nt 5, encurtando a haste para 4 bp (nts 4,6-8 e 36-39) e adicionando um terminal CG bp (Figura 1A, etapa 1). Além disso, uma das fitas SLAS contém nts 9-29 da sequência central DAP-10-42, enquanto outra fita SLAS contém nts 30-35 da sequência.</li>
	<li>Estenda a sequência de 3 'terminais do fragmento contendo nts 9-29 com d (GGTCAT) e a sequência de 5 'terminais do fragmento nts 30-35 com d (ATGACC) para formar uma haste 2 de 6 pb (Figura 1A, etapa 2). NOTA: Os pares de bases T4-A39, A6-T38, C7-G37 e G8-C36 da haste 1 em DAP-10-42 são necessários para a função de iluminação do aptâmero. A sequência da haste 1' pode ser modificada apenas no bp terminal e pode ser um par de bases G-C, A-T, T-A ou estendida com 1-2 pares de bases, conforme necessário. A sequência da haste 2 é arbitrária e pode ser alterada. No entanto, recomenda-se que a estabilidade termodinâmica do caule 2 seja preservada, a menos que a temperatura do ensaio seja elevada acima de 28 °C. O encurtamento ou a desestabilização da haste 2 evita a ligação prematura do corante sem um alvo se for observado um fundo alto do ensaio fluorescente baseado em SLAS. A divisão da sequência de nucleotídeos DAP-10-42 entre nts 28-29, 27-28 ou 26-27 em vez de nts 29-30 também é permitida (Figura 1B).</li>
	<li>Para adaptar o SLAS projetado a um alvo ou interesse de ácido nucleico, estenda a haste 1 'com sequências de DNA complementares aos fragmentos de ligação alvo-alvo (braços) por meio de ligantes d (TT) (Figura 1A, etapa 3). Isso produz as sequências de fitas SLAS-U e SLAS-S que constituem a sonda.</li>
	<li>Torne o braço de ligação ao alvo do SLAS-S complementar a um fragmento de 7-10 nt do alvo que contém o local SNS e o braço de ligação ao alvo do SLAS-U – complementar a um fragmento de 15-25 nt do alvo adjacente ao braço de ligação ao alvo do SLAS-S (Tabela 1). NOTA: É opcional conectar o braço de vinculação de alvo do SLAS-S ao nt 4 ou nt 39 da sequência DAP-10-42 (Figura 1, braço 1 ou braço 2, respectivamente).</li>
	<li>Avalie a temperatura de fusão (Tm) dos duplex entre o alvo de interesse e os braços de ligação ao alvo do SLAS-S e SLAS-U usando o UNAFold Web Server (unafold.org)19.<ol>
		<li>Clique na guia DINAMelt no topo da página da web; vá para Aplicativos e selecione Hibridização de fusão de dois estados (Figura 3A suplementar). Na página Hibridização de fusão de dois estados, insira uma das sequências de interação na caixa da esquerda e outra na caixa da direita (Figura 3B suplementar). Certifique-se de que ambas as sequências estejam na ordem de 5 'a 3'. Você pode inserir mais de um par de sequências de interação separando-as com ponto-e-vírgula.</li>
		<li>Na parte inferior da página, indique a temperatura do ensaio (22 °C), as concentrações de catiões monovalentes e divalentes (20 mM e 25 mM, respectivamente) para corresponder às condições do ensaio. Indicar a concentração das sequências que interagem.</li>
		<li>Pressione Enviar (Figura 3B suplementar). Observe os resultados que incluem a mudança de energia de Gibbs, mudança de entalpia e mudança de entropia da ligação, bem como os valores de Tm para os duplexes correspondentes (Figura Suplementar 3B).</li>
		<li>Certifique-se de que os valores de Tm para os duplex entre o alvo totalmente correspondente (M) e os braços de ligação ao alvo de SLAS-S e SLAS-U estejam acima da temperatura do ensaio, que é de 22 °C no protocolo atual. Aqui, os valores de Tm foram 32,2 ° C e 74,4 ° C, respectivamente (Figura Suplementar 3C).</li>
		<li>Certifique-se de que o duplex entre SLAS-S e um alvo incompatível (MM) contendo um SNS tenha um Tm abaixo da temperatura do ensaio. Isso garante alta seletividade do reconhecimento da sonda-alvo, evitando que o fluorogênio AO sinalize a presença do analito de ácido nucleico alvo se ele contiver um SNS no fragmento de ligação ao SLAS (Figura 2). Aqui, o Tm foi de 21,3 ° C (Figura Suplementar 3C), o que foi suficiente para discriminar a incompatibilidade do complexo correspondente.</li>
		<li>Ajustar as sequências dos braços de ligação ao alvo, encurtando ou alargando os fragmentos complementares do alvo, se necessário, para satisfazer os requisitos de estabilidade indicados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obtenha as fitas projetadas SLAS-S e SLAS-U de qualquer fornecedor comercial que forneça oligonucleotídeos de DNA personalizados ou sintetize as fitas de DNA internamente usando um sintetizador automatizado de oligonucleotídeos.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
Figura 1: Conversão de um aptâmero de luz fluorescente (FLAP) DAP-10-42 em um sensor de aptâmero de luz dividida (SLAS). (UMA)A estrutura secundária do DAP-10-4212 é prevista por uma aplicação de dobramento de DNA do UNAFold Web Server19 a 22 ° C, 20 mM Na+, 25 mM Mg2+. O aptâmero apresenta uma estrutura secundária em grampo com um núcleo que presumivelmente se dobra em um motivo G-quadruplex estabilizado pela haste 1. Para que o DAP-10-42 seja convertido em um SLAS, (1) a haste 1 do aptâmero é encurtada para 4 bp e flanqueada por um GC bp adicional para formar a haste 1 '; (2) a sequência central é dividida entre nts 29 e 30, com os lados 3' e 5' do local dividido estendidos com sequências complementares d (GGTCAT) e d (ATGACC), respectivamente, para formar a haste 2; (3) a haste 1' é estendida com as sequências complementares aos fragmentos adjacentes de um alvo de interesse - braços de ligação ao alvo, com um ligante d (TT) entre os braços de ligação ao alvo e o domínio de relatório de sinal da sonda. (B) O núcleo também pode ser dividido entre nts 28-29, 27-28 ou 26-27 sem perda significativa do sinal e / ou aumento da dobra de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
Figura 2: Mecanismo de geração de sinal SLAS. O SLAS é composto por duas fitas - SLAS-U e SLAS-S - e um corante fluorogênico (por exemplo, Auramina O; AO). Na ausência de um alvo de interesse de ácido nucleico, ambas as fitas estão no estado dissociado e incapazes de ligar o corante; nenhum sinal é observado (centro). Na presença de um alvo M totalmente correspondente, tanto o SLAS-U quanto o SLAS-S hibridizam com o fragmento adjacente de M para aproximar os fragmentos do núcleo. Isso permite a formação do local de ligação do corante. A ligação de AO aumenta sua fluorescência, que é medida como uma leitura de sinal fluorescente (esquerda). Na presença de um alvo MM incompatível contendo uma substituição de nucleotídeo único (SNS) em um fragmento interagindo com SLAS-S, apenas SLAS-U pode hibridizar com o alvo MM , enquanto SLAS-S está no estado dissociado. Isso evita a formação do local de ligação do corante e nenhum sinal é observado (direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Amplificação da sequência visada
<ol>
	<li>Amplificar um fragmento do gene a ser analisado com o ensaio SLAS. Para amplificação por PCR ou RPA, use condições assimétricas (por exemplo, com o Forward Primer adicionado a 10 vezes mais do que o Reverse Primer) para gerar um amplicon de fita simples. Para amplificar um fragmento de 126 nt do gene NANOGP8 usando Linear After The Exponential (LATE) PCR20, use as sequências de primer listadas na Tabela 2. Aqui, foi utilizado um molde de DNA de fita simples (Modelo NANOGP8 ou Modelo G1423C, Tabela 2) correspondente ao fragmento de 126 nt do gene. O modelo foi sintetizado de forma personalizada pela Integrated DNA Technologies, Inc.<ol>
		<li>Prepare uma reação de PCR de 100 μL misturando 10 μL de tampão de reação Taq padrão 10x, 2 μL de mistura dNTP 10 mM (para obter a concentração final de 0,2 mM), 10 μL de primer direto de 10 μM e 10 μL de primer reverso de 1 μM (para a concentração final de 1 μM e 0,1 μM), respectivamente), 0,5 μL de Taq DNA polimerase 5U/μL, molde de DNA e água livre de nuclease. Para um controle sem modelo, adicione água em vez do modelo.</li>
		<li>Utilizar as seguintes condições de termociclagem: desnaturação inicial a 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de (1) desnaturação a 95 °C durante 15 s, (2) recozimento do primer a 60 °C durante 30 s, (3) extensão do primer a 68 °C durante 30 s; e extensão final a 68 °C por 5 min. NOTA: Técnicas de amplificação baseadas em transcrição, como NASBA18 , podem ser usadas em vez de PCR ou RPA, especialmente se um modelo de RNA estiver disponível para amplificação. O NASBA gera um amplicon de RNA de fita simples em uma concentração de produto final na faixa micromolar, que é alta o suficiente para ser usada no ensaio SLAS a jusante sem concentração de produto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Precipitar as amostras amplificadas com etanol adicionando 0,1x volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,5) e 3x volume de etanol. Incubar a -20 °C por 1 h, centrifugar a 12.000-18.000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave o pellet com etanol a 70%, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante novamente. Seque o pellet ao ar e dissolva em 10 μL de água livre de nuclease para ser usado no ensaio SLAS.</li>
</ol>
3. Ensaio de fluorescência usando SLAS
<ol>
	<li>Prepare soluções estoque de AO (0,1 mM em DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM em água livre de nuclease, 10x), SLAS-U (10 μM em água livre de nuclease, 10x) e 4x tampão de ensaio (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 80 mM KCl). NOTA: Os íons de potássio são necessários para estabilizar o motivo G-quadruplex presumido do aptâmero, que faz parte do local de ligação do corante. Apenas 1 mM KCl (a 25 mM MgCl2) em tampão de ensaio 1x é suficiente para garantir um aumento de fluorescência de ~ 14 vezes na presença do alvo específico M sobre o branco (amostra sem alvo; Figura suplementar 2B). Os íons de magnésio estabilizam as interações das fitas de ácido nucleico (entre SLAS-S, SLAS-U e o alvo). A concentração de Mg2+ no tampão de ensaio 1x deve ser de pelo menos 5 mM (a 20 mM KCl; Figura Suplementar 2C,D). A solução estoque de AO (~ 1 mM) é preparada em DMSO. As concentrações de estoque de SLAS-S e SLAS-U são arbitrárias e podem ser ajustadas, se necessário, desde que as concentrações finais das fitas sejam mantidas (consulte a justificativa para a seleção da concentração final de SLAS em Discussão). CUIDADO: AO é prejudicial se ingerido, tóxico em contato com a pele e suspeito de causar câncer. Sempre use luvas ao trabalhar com soluções AO. A pesagem do AO e a preparação de suas soluções de estoque devem ser feitas sob o capuz químico.</li>
	<li>Prepare a mistura principal contendo todos os componentes do ensaio, exceto o alvo. Calcular o volume da mistura principal (mistura V) multiplicando o volume da amostra (60 μL) pelo número de amostras mais uma (n+1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> O número de amostras n deve incluir os controlos negativos e positivos necessários.</li>
	<li>Combine 0,25x Vmix μL de 4x Assay Buffer, 0,1x Vmix μL de 0,1 mM AO, 0,1x Vmix μL de 10 μM SLAS-S e 0,1x Vmix μL de 10 μM SLAS-S. Adicionar água livre de nuclease ao volume final de <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> modo a acomodar o volume alvo adicionado no passo 3.4. Vortex e centrifugue brevemente a mistura master. Alíquota de 50 μL da mistura principal em n tubos de amostra. NOTA: O sample volume pode ser ajustado dependendo das características do instrumento utilizado para detectar o sinal fluorescente. O volume da mistura principal que é aliquotado em tubos de amostra pode ser ajustado com base no volume alvo adicionado na etapa 3.4. O volume de água livre de nuclease adicionado para fazer a mistura principal deve ser ajustado de forma correspondente. Por exemplo, se a amostra contendo o alvo for adicionada a 10% (V/V) do volume final da amostra, a água deve ser adicionada à mistura principal até 0,9x Vmistura.</li>
	<li>Use uma amostra como controle sem alvo (em branco) e uma amostra como controle positivo. Adicione 10 μL da amostra contendo alvo à mistura principal (50 μL) para fazer o volume final da amostra de 60 μL contendo 10-1000 nM alvo. Para o branco, use água livre de nuclease (10 μL) em vez do alvo. Para controle positivo, use um oligonucleotídeo de DNA sintético contendo a sequência alvo (por exemplo, alvo M, Tabela 1). Adicione 10 μL de controle de 0,6-3 μM para fazer uma concentração final de 0,1-0,5 μM. NOTA: A alta fluorescência neste controle positivo garante que o ensaio funcione conforme o esperado, mesmo que um sinal negativo seja observado para as amostras desconhecidas testadas.</li>
	<li>Misture as amostras e gire para baixo usando uma microcentrífuga. Incubar as amostras a 22 °C durante 10-60 min. O sinal aumenta apenas em &lt;15% entre 40 min e 60 min (Figura 3).</li>
	<li>Medir a fluorescência das amostras a 540 nm após excitação a 475 nm utilizando um espectrofotómetro fluorescente. NOTA: É possível usar um fluorômetro portátil que mede a fluorescência em tubos de PCR de paredes finas. O fluorômetro precisa ter filtros de excitação e emissão adequados para detectar a fluorescência AO. Um exemplo de um filtro de excitação adequado é um passa-curto de 495 nm. Um exemplo de filtro de emissão adequado é 510-580 nm. Alternativamente, o sinal pode ser observado visualmente após a excitação da fluorescência AO na amostra com uma fonte de luz UV ou azul. CUIDADO: Se uma lâmpada UV for usada, use óculos de proteção UV.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
Figura 3: Dependência do tempo da geração de sinal para SLAS-29U/30S. Uma amostra contendo AO, SLAS-29U e SLAS-30S foi analisada usando o modo cinético de um espectrofotômetro fluorescente (excitação a 475 nm, emissão a 540 nm, excitação/fendas de emissão de 5 nm) durante 60 min. Em um tempo de 5 minutos (indicado com uma seta), o alvo M foi adicionado à amostra. Os dados são calculados a partir de dois ensaios independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Wetmur, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Probes%3A+Applications+of+the+principles+of+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacons%3A+Probes+that+Fluoresce+upon+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization.</a> Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+biosensor+molecular+beacon+probe%3A+challenges+and+recent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions.</a> Scientifica. 2012, 928783(2012).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary+DNA+probe+for+highly+specific+nucleic+acid+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition.</a> J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+probes+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Binary probes for nucleic acid analysis.</a> Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).</li>
<li>Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+hybridization+enables+discrimination+of+a+point+mutation+within+5-40+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C.</a> J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+16S+rRNA+using+a+molecular+beacon-based+X+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor.</a> Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecular+beacon+probe+is+sufficient+for+the+analysis+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences.</a> Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).</li>
<li>Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+isolation+of+aptamers+to+light-up+the+dyes+and+the+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications.</a> Analyst. 145, 701-718 (2020).</li>
<li>Du, Y., Li, B., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFitting%26%2334%3B+makes+%26%2334%3Bsensing%26%2334%3B+simple%3A+Label-free+detection+strategies+based+on+nucleic+acid+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">&#34;Fitting&#34; makes &#34;sensing&#34; simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers.</a> Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+%28split%29+light-up+aptameric+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Binary (split) light-up aptameric sensors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).</li>
<li>Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+fluorophore--DNA+aptamer+pair+for+label-free+turn-on+aptamer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors.</a> Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).</li>
<li>Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+dye+binding+by+a+light-up+aptamer%3A+Application+for+label-free+multi-wavelength+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing.</a> Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).</li>
<li>Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+dapoxyl+aptamer+for+sequence-selective+analysis+of+nucleic+acid+sequence+based+amplification+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons.</a> Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+detection+in+biologically+relevant+media+using+a+split+aptamer+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform.</a> Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+light+up+aptamers+as+a+probing+tool+for+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids.</a> Methods. 197, 82-88 (2021).</li>
<li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clin Chem. 62, 947-958 (2016).</li>
<li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).</li>
<li>Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear-after-the-exponential+%28LATE%29-PCR%3A+primer+design+criteria+for+high+yields+of+specific+single-stranded+DNA+and+improved+real-time+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).</li>
<li>Grochans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+glioblastoma+multiforme-Literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review.</a> Cancers. 14, 2412(2022).</li>
<li>Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sequences+of+exosomal+NANOG+DNA+as+a+potential+diagnostic+cancer+marker%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker.</a> PLoS One. 13, e0197782(2018).</li>
<li>Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stability+of+DNA+duplexes+in+solutions+containing+magnesium+and+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations.</a> Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).</li>
<li>Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+cations+in+G-quadruplex+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal cations in G-quadruplex folding and stability.</a> Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).</li>
<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Auramina O</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>195064</td><td>um corante fluorogênico usado para relatórios de sinais</td></tr><tr><td>Fluorômetro Cary Eclipse</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>G9800A</td><td>para medir o sinal fluorescente das amostras</td></tr><tr><td>Sulfóxido de Dimetila</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>196055</td><td>solvente para preparar soluções-mãe de Auramina O</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos de DNA (primers, fitas SLAS, molde sintético para PCR)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>feito sob medida e dessalgado pelo vendedor, usado sem purificação adicional</td></tr><tr><td>Mistura dNTP, 10 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0191</td><td>para reação de PCR TARDIO</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>invitrogen</td><td>AM9530G</td><td>componente tampão; necessário para a correta associação das fitas da sonda com o alvo analisado</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 mL)</td><td>Marca de pescador</td><td>02-681-320</td><td>plástico para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Micropipeta (0,1-2,5 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K56877G</td><td>usado para a preparação da amostra</td></tr><tr><td>Micropipeta (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K13160F</td><td>usado para a preparação da amostra</td></tr><tr><td>Micropipeta (20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>J05253M</td><td>usado para a preparação da amostra</td></tr><tr><td>Micropipeta (2-20 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>G24675G</td><td>usado para a preparação da amostra</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Corning&nbsp;</td><td>6770</td><td>usado para girar as amostras&nbsp;</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease (não tratada com DEPC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9932</td><td>Uso para amostras em ensaios de PCR e SLAS</td></tr><tr><td>Tubos de PCR (0,5 mL)</td><td>invitrogen</td><td>AM9932</td><td>para medir a fluorescência usando o fluorômetro Quantus</td></tr><tr><td>Pontas Pipett (20-200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td>plástico para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (1-10 uL)</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td>plástico para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>componente tampão; necessário para o dobramento correto do domínio aptâmero de luz fluorescente da sonda</td></tr><tr><td>Fluorômetro Quântico</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td>fluorômetro portátil de baixo custo que pode ser usado para medições de fluorescência</td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo</td><td>Starna</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>a ser usado para medição de fluorescência usando o fluorômetro Cary Eclipse</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase com Tampão Taq Padrão</td><td>BioLabs da Nova Inglaterra</td><td>M0273S</td><td>para amplificação de um fragmento de gene a ser analisado com o ensaio SLAS&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão Tris-HCl (pH 7,4)</td><td>Boston Bioprodutos</td><td>R-314</td><td>componente de buffer</td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>UVP</td><td>95-0016-14</td><td>para excitar AO para observação de sinal visual</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>usado para misturar as amostras</td></tr></tbody></table>

sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de dna como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

O desempenho do SLAS utilizando o núcleo DAP-10-42 como repórter de sinal foi demonstrado usando uma sonda projetada para interrogar um fragmento do gene NANOGP8 importante para a progressão do glioblastoma multiforme (GBM), uma forma agressiva de câncer cerebral21. Foi relatado que este fragmento contém SNSs na carga de DNA de exossomos derivados de células cancerígenas22. Portanto, o SLAS foi adaptado ao local SNS do gene. Os alvos de DNA sintético M ou ...

Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

DNA-based fluorescent light-up aptamers (FLAPs) are promising for bioanalytical assays because they provide a low-cost fluorescent signal readout without ...

split-hybridization-probe-utilizing-dna-fluorescent-light-up-aptamer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.

Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

Neste vídeo, as células infectadas com vírions MCPyV foram submetidas a uma reação em cadeia de hibridização in situ para detectar genomas específicos do MCPyV. Além disso, a técnica DNA-HCR foi combinada com FISH para visualizar o DNA MCPyV em células da pele humana infectadas.

HCR-DNA FISH: Uma técnica de hibridização in situ de fluorescência para detectar DNA viral em células infectadas

Este vídeo descreve uma estratégia de hibridização sequencial que envolve a hibridização de sondas de mRNA para mRNA alvo específico. Após a hibridização da sonda, a amplificação do sinal é realizada para melhorar a resolução por meio da redução da relação sinal-ruído durante o RNA-CISH de amostras histológicas.

Hibridização de sonda e amplificação de sinal em hibridização in situ de RNA: uma técnica para detectar sequências específicas de RNA em seções de tecido

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

Os corantes fotoestáveis de cianina são ligados a oligonucleotídeos para monitorar a hibridização por transferência de energia.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Os ácidos nucléicos são analitos comuns para avaliar sistemas biológicos; no entanto, o viés da manipulação enzimática pode causar preocupação. Aqui é descrito um método para detecção sem marcação de ácidos nucléicos usando polianilina. Essa tecnologia de sensor sensível e econômica pode distinguir diferenças de nucleotídeo único entre moléculas.

Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

Aprenda a desenvolver sondas de hibridização dividida para análise de ácidos nucleicos com detecção específica de sequências. Este método utiliza o aptâmero fluorescente DAP-10-42 como repórter de sinal sem marcação.

Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica (Vídeo) | JoVE Journal

Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

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