Uma estrutura de imagem multimodal para avançar a fenotipagem de células vivas de câncer de mama sem rótulos

Agora, em nosso protocolo, apresentamos imagens multimodais usando microespectroscopia Raman confocal e microscopia de fase tomográfica para fenotipagem morfoquímica rápida e imparcial de células de câncer de mama humano em seu ambiente fisiológico nativo. A combinação de microespectroscopia Raman e microscopia de fase de tomografia permite imagens sem marcação sob condições fisiológicas, fornecendo informações bioquímicas e morfológicas sobre as células e abordando a limitação dos métodos perturbativos convencionais, como marcação de fluorescência ou fixação química. Nossos resultados demonstram um alto potencial de implementação de abordagem multimodal no fornecimento de fenotipagem morfoquímica de células de câncer de mama. Além disso, sua versatilidade, reprodutibilidade e não invasividade tornaram uma ferramenta promissora para uma ampla gama de aplicações biomédicas, desde estudos fundamentais de biologia celular até diagnósticos.

Nosso objetivo é criar um atlas de biomarcadores ópticos para controle de qualidade embrionária não invasivo, detecção de senescência celular e triagem de medicamentos em modelos organoides para avançar na medicina regenerativa e na pesquisa de doenças.

[Instrutor] Para começar, coloque a amostra de células de câncer de mama humano MDA-MB-231 na incubadora no palco. Adicione água para a objetiva de imersão em água. Ligue o alimentador automatizado de imersão em água para fornecer água à lente objetiva. Verifique regularmente os níveis de água para evitar a evaporação e garantir condições de imagem consistentes durante as medições. Agora, ligue o laser da bomba e ajuste sua saída para atingir uma potência de laser de 75 miliwatts no sample plano. Abra o software de controle do microscópio Micro-Manager. Nas definições de configuração, selecione BF e clique em ao vivo no lado esquerdo da janela do software. Escolha a célula única desejada e clique em parar para encerrar a visualização de campo claro. Abra o software de controle da câmera CCD. Na configuração do experimento, defina o tempo de exposição para 1,5 segundos. Clique em executar na barra de ferramentas do experimento e ative o feixe de laser. Em seguida, ajuste a posição Z para maximizar a contagem de sinais na região da impressão digital de 600 a 1.800 centímetros inversos e, em seguida, desligue o laser. Clique em parar na barra de ferramentas do experimento e saia do software. Inicie o processo de aquisição de dados usando o script MATLAB, que gerencia automaticamente os canais Raman em medições multidimensionais e salva os dados. Defina o campo de visão para 50 por 50 micrômetros quadrados com uma resolução de 40 por 40 pixels, cada pixel cobrindo 1,25 por 1,25 micrômetro quadrado. Defina o tempo de exposição para cada espectro Raman para 1,5 segundos e execute o script MATLAB. Para o pós-processamento de mapas hiperespectrais Raman, inicie a ferramenta baseada na web RamApp. Importe os dados hiperespectrais clicando em novo na guia minhas análises e carregue o arquivo .mat contendo as variáveis de dados espaciais e espectrais, juntamente com a variável do eixo X. Para truncar o espectro, no menu cortar e girar, escolha corte espectral. Defina as bordas inferior e superior da região de deslocamento Raman como 600 e 1.800 centímetros inversos, respectivamente. Para corrigir os raios cósmicos, vá para redução de ruído, clique em despike, selecione Z-score como método e defina o limite para oito. Marque as opções use a primeira diferença e corrija os picos e, em seguida, clique em executar para aplicar a correção. Para remover o ruído dos mapas, clique em mapa suave, escolha o filtro mediano, defina o tamanho do quadrado para três pixels e clique em executar. Para suavizar o espectro de cada pixel, escolha o filtro Savistky-Golay. Defina o comprimento da janela de filtro como sete e a ordem polinomial como dois e clique em executar. Para subtrair o sinal de fundo médio, abra a remoção do substrato óptico e clique em identificar substrato. Defina k-means como o método com dois clusters. Em seguida, clique em Opções avançadas. Escolha a limpeza morfológica para remover pequenos blobs do primeiro plano e clique em executar. Para remover o sinal de fundo médio, clique em remover substrato, escolha a média global ou a média do método central de 95% dos valores e clique em executar. Para corrigir a fluorescência da linha de base, abra o painel da linha de base, clique em corrigir linha de base, selecione PLS de suavidade adaptativa, defina lambda como 5 milhões e clique em executar. Para a normalização de cada mapa hiperespectral Raman, vá para diversos, selecione normalizar, escolha o método Frobenius e clique em executar. Para gerar uma imagem de cor falsa mostrando a distribuição subcelular, no painel de imagens, clique no símbolo do menu aberto em imagem de intensidade e, em seguida, clique em editar imagem. No painel de edição, selecione banda única e defina o intervalo espectral. Agora, escolha a cor dupla no mapa de cores e defina a cor, o limite de intensidade e a opacidade antes de clicar em confirmar. Para o download de um único espectro de ponto, escolha um pixel de interesse e, no painel de legenda espectral, clique em baixar espectro. Por fim, para exportar espectros de primeiro plano e substrato, navegue até a legenda espectral e clique em baixar espectro para as seções de primeiro plano e substrato. Coloque uma gota de água destilada na lente objetiva do microscópio. Posicione a amostra no estágio de tradução do microscópio e, em seguida, ajuste a posição da amostra para alinhá-la com a lente objetiva. Ligue o microscópio e inicie o software de imagem. Clique no ícone do microscópio na barra de ferramentas. Após a inicialização, clique em configuração, selecione célula ativa no painel de trabalho e PBS como mídia. Em seguida, acesse a guia de calibração no painel de controle do software de imagem. Defina as posições axiais das lentes objetiva e condensadora selecionando foco e superfície, respectivamente. Agora, clique no modo de digitalização para ajustar manualmente as lentes e garantir que os padrões de iluminação estejam centralizados e quase estáticos. Escolha o modo normal e ajuste o estágio de tradução para trazer a célula para o campo de visão e focar na amostra. Ajuste o estágio de tradução para localizar uma região sem células. Escolha calibrar para capturar vários hologramas 2D em ângulos de iluminação variados. Ajuste o estágio de tradução para centralizar a célula, navegue até a guia de aquisição e selecione Instantâneo 3D para capturar o tomograma da célula. Para visualizar os tomogramas holográficos, selecione os dados no painel de navegação de dados, clique com o botão direito do mouse e clique em abrir. No painel do gerenciador de dados, clique em tomograma RI. No painel de visualização de volume, selecione RI e desenhe quatro caixas de cores retangulares na tela de RI. Defina os valores mínimo e máximo do intervalo de RI para cada caixa de cores e, em seguida, associe uma opacidade e uma cor a cada caixa. Clique em salvar para armazenar os intervalos de RI e as caixas de cores definidos. Para obter descritores quantitativos da morfologia celular, utilize a interface de análise. Selecione manual no painel de segmentação, defina 1,3450 como o limite de RI e clique em aplicar. Clique em salvar para salvar os índices morfológicos calculados. O mapeamento espectral Raman revelou a distribuição espacial do citoplasma, núcleo, fenilalanina e lipídios dentro de células individuais de MDA-MB-231. Picos espectrais Raman distintos correspondentes a citoplasma, núcleo, fenilalanina e lipídios foram confirmados na região da impressão digital entre 600 e 1.800 centímetros inversos. Os mapas de calor do índice de refração de células individuais revelaram a distribuição interna dos componentes subcelulares nos planos axial XY, plano YZ sagital e planos XZ coronais. Uma reconstrução tomográfica 3D identificou regiões de índice de refração volumétrica correspondentes a subestruturas internas. As medidas morfológicas quantitativas de uma única célula MDA-MB-231 mostraram diferentes descritores de morfologia celular, com um volume total de 4024.189 micrômetros cúbicos e área superficial de 2383.707 micrômetros quadrados, com um índice de refração médio de 1.356.