Name: In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprenda biotinilação de proximidade in vivo em Paramecium tetraurelia usando turboID ligase. Este método permite marcar proteínas especificamente e estudar interações proteicas em organismos unicelulares.

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<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
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<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
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<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
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<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
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<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscópio Axiovert 40 CFL (lentes 10x, 40x)</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>b-sitosterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Rolamento A9647</td><td></td></tr><tr><td>Óleo CellTram</td><td>Ependorf</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>sequência de DNA 3xHA-turboID otimizada para códons</td><td>Biociência de torção</td><td>na</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCCTTACGAT GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAATATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTCTCCTTTTTTbr GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGATGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer Scientific</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>Pontas do microcarregador epT.I.P.S.</td><td>Ependorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Grogg Chemie</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Ependorf</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Femtotip II</td><td>Calibre Científico</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Rolamento F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Aplicação</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>mAB de coelho HA-tag (C29F4)</td><td>sistemas celulares</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI 2</td><td>Ependorf</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>médio claro</td><td>na</td><td>na</td><td>0,2x solução de pó de grama de trigo em 2,5 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8691</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-clorofórmio-isoamilalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fósforo</td><td>Fischer Scientific</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>Kit de plasmídeo mais midiprep</td><td>Qiagene</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>meio rico</td><td>na</td><td>na</td><td>1x solução de pó de grama de trigo em 2,5 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>Estreptavidina-FITC</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Ultrafree-MC GV&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>solução de lavagem</td><td>na</td><td>na</td><td>0,1% BSA em água Volvic;</td></tr><tr><td>solução de grama de trigo em pó</td><td>Pinheiros internacionais</td><td>na</td><td>Prepare como um caldo 20x do pó conforme descrito anteriormente (0,5g / 10mL)</td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos magnáticos revestidos com estreptavidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise para pulldown</td><td>na</td><td>na</td><td>50 mM Tris pH 8; NaCl 150 mM; 0,5% de desoxicolato de sódio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x inibidor de protease completa (Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem 1 para pulldown</td><td>na</td><td>na</td><td>50 mM Tris pH 8; NaCl 150 mM; 0,5% de desoxicolato de sódio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem 2 para pulldown</td><td>na</td><td>na</td><td>10 mM Tris pH 7,4; NaCl 150 mM; 0,01% NP40; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem 3 para pulldown</td><td>na</td><td>na</td><td>10 mM Tris pH 7,4; NaCl 150 mM;</td></tr></tbody></table>

in vivo biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em paramecium tetraurelia

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

Nosso protocolo descreve um método simplificado para a introdução de uma modificação covalente da biotina nas proteínas nas proximidades de uma proteína alvo em Paramecium (Figura 1A). Essas proteínas biotiniladas podem então ser enriquecidas usando um pulldown de estreptavidina e identificadas usando espectrometria de massa20. Para demonstrar um caso de uso prático do método, aplicamos o protocolo à proteína Nowa1. Essa proteína é essencial para o processo de rearranjo genômico e apresenta alterações dinâmicas em sua localização12. Nos estágios iniciais, permanece no antigo núcleo somático e se fragmenta, mas depois está localizado no novo núcleo em desenvolvimento. Notavelmente, nossas tentativas anteriores de um enriquecimento mediado por tags das proteínas de interação Nowa1 não tiveram sucesso (resultados não publicados). Isso provavelmente se deveu às repetições complexas com semelhança com a proteína príon PrP27 que poderia causar autoagregação em condições não ideais durante o procedimento de pulldown21. A PCR amplificou a região codificante Nowa1 junto com sua região não codificante upstream contendo o promotor. O produto foi então inserido no quadro com uma sequência de codificação turboID otimizada para códon (Figura 1B). Para evitar o silenciamento induzido por transgênicos causado pela injeção de DNA circular em Paramecium, o vetor foi linearizado antes da injeção. O DNA linearizado e purificado foi então microinjetado no núcleo somático (MAC) conforme descrito neste protocolo. Uma gotícula dispersa confinada na região mais escura do núcleo somático tornou-se visível em algumas das injeções bem-sucedidas (Figura 1C). A injeção bem-sucedida e a amplificação do DNA pelas células durante a divisão celular foram então verificadas por PCR. Como esperado, 40-50% das células foram positivas para o DNA injetado da construção Nowa1 (tamanho esperado do produto 685 pb) (Figura 2). O próximo passo foi verificar a presença da proteína codificada pelo DNA injetado. Como o vetor receptor contém a sequência turboID ladeada por uma etiqueta tripla de HA, usamos coloração de imunofluorescência para detectar a marca. Isso nos permitiu verificar se as células injetadas estão expressando a proteína de fusão e se ela estava devidamente localizada. Usamos células em estágio avançado que mostraram localização da proteína de fusão nos dois novos núcleos em desenvolvimento, como observado anteriormente para a proteína Nowa1 do tipo selvagem12. As linhagens celulares individuais injetadas apresentaram diferentes níveis da proteína de fusão (Figura 3). Um nível de expressão mais baixo pode ser benéfico para aplicações onde o fundo reduzido é desejável, mas, neste caso, optamos pelo sinal máximo e prosseguimos com o clone 2, que apresentou a expressão mais alta. Em seguida, coletamos amostras durante diferentes estágios de desenvolvimento para rastrear a localização da proteína de fusão. A proteína foi inicialmente localizada nas meadas formadas a partir do antigo núcleo somático e nos fragmentos nucleares separados durante os estágios iniciais da autogamia. Após o aparecimento da anlagen nuclear, a proteína de fusão fez a transição para esses novos núcleos em desenvolvimento (Figura 4). Para promover a biotinilação do proteoma proximal nos diferentes estágios, suplementamos a cultura com 500 μM de biotina por 2 h antes da colheita das células para IF. Visualizamos as proteínas marcadas com biotina por meio de uma coloração IF usando uma estreptavidina marcada com fluorescência. O sinal observado correspondeu à localização da proteína de fusão marcada com HA. É importante ressaltar que foi possível obter uma localização de biotinilação específica para os diferentes estágios de desenvolvimento nuclear, pois mesmo uma incubação curta com biotina é suficiente para alcançar uma biotinilação significativa (Figura 4). Além disso, sem a adição de biotina suplementar, apenas a biotinilação insignificante foi detectável nas células injetadas. Em células do tipo selvagem, a adição de biotina suplementar não causou biotinilação detectável (Figura 5A). Notavelmente, a biotina não estava apenas se acumulando no núcleo em desenvolvimento, pois mesmo em condições de desnaturação, ela permanece ligada às proteínas. (Figura 5B). Usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina, foi possível enriquecer seletivamente as proteínas biotiniladas (Figura 6). As proteínas enriquecidas podem ser identificadas usando espectrometria de massa. Nesses experimentos subsequentes de identificação de proteínas, a cultura não suplementada, bem como as células que expressam uma proteína turboID não fundida, podem ser usadas como grupos de controle de fundo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do procedimento de biotinilação por proximidade em P. tetraurelia. (A) Esboço generalizado do protocolo. (B) Princípio de clonagem para o vetor receptor turboID plug-and-play e a construção resultante para a proteína de fusão Nowa1. A região 3'UTR usada neste plasmídeo é derivada de CenH3a. (C) Gotícula difusa visível contida na área mais escura correspondente ao núcleo somático (MAC) após uma injeção bem-sucedida de DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
Figura 2: Teste de PCR para injeção bem-sucedida. Análise em gel de agarose da reação de PCR para um produto com um primer direto específico para a região a montante, codificação para resistência à ampicilina (amp start) e um primer reverso complementar ao Nowa1. A ponta da seta mostra o tamanho esperado do produto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
Figura 3: Coloração por imunofluorescência para validar a localização correta da proteína de fusão turboID. Coloração por imunofluorescência usando anticorpo primário anti-HA de coelho (1:100) e anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 568 de cabra (1:1000) de linhagens monoclonais de Paramecium com sinal de PCR positivo para o DNA que codifica uma proteína de fusão Nowa1-HA-turboID. Escala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
Figura 4: Biotinilação específica de Nowa1 em diferentes estágios de desenvolvimento. Coloração por imunofluorescência da linha monoclonal 2 em estágios progressivos durante a formação do novo núcleo somático. O meio de cultura foi suplementado com 500 μM de biotina para atividade ideal de turboID. A marca HA foi detectada como na Figura 3, e a biotina foi detectada usando Streptavidin-FITC (1:200). Escala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
Figura 5: A marcação de proximidade eficiente por turboID requer biotina suplementar na cultura. (A) Coloração por imunofluorescência de células wt e injetadas no estágio final de desenvolvimento mostrando a expressão de Nowa1-HA-turboID e a biotinilação observada com 500 μM de biotina suplementar. HA-tag e biotina foram detectados como na Figura 4. Escala 20 μm. (B) Análise de Western blot para biotina usando HRP-estreptavidina de células wt cultivadas com 500 μM de biotina e células injetadas turboID com e sem biotina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
Figura 6: Enriquecimento de proteínas biotiniladas com esferas magnéticas de estreptavidina. Análise de Western blot para biotina de amostras de um experimento pulldown usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. As amostras são: Nowa1-HA-turboID lisado de células (entrada), a fração não ligada (fluxo), as etapas de lavagem (lavagem 1-6) e as proteínas ligadas aos grânulos (saída). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

São apresentados aqui protocolos para ensaios bioquímicos in vitro usando rótulos de biotina que podem ser amplamente aplicáveis para o estudo de interações ácido proteína-nucleico.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

A transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) é uma técnica de imagem para detectar interações proteicas em células vivas. Aqui, um protocolo FRET é apresentado para estudar a associação de enzimas modificadoras de histona com fatores de transcrição que as recrutam para os promotores alvo da regulação epigenética da expressão gênica em tecidos vegetais.

Investigando interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição in vivo por transferência de energia de ressonância de fluorescência

Neste estudo, estabelecemos um protocolo detalhado para marcação de proximidade (PL) baseada em TurboID no ovário de D. melanogaster , abrangendo etapas desde a suplementação de biotina e dissecção do ovário até a validação da expressão transgênica e enriquecimento de peptídeos biotinilados para espectrometria de massa.

In vivo Aplicação da rotulagem de proximidade baseada em TurboID em Drosophila melanogaster

Aprenda biotinilação de proximidade in vivo em Paramecium tetraurelia usando turboID ligase. Este método permite marcar proteínas especificamente e estudar interações proteicas em organismos unicelulares.

In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia

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