Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

Os genomas podem fornecer informações sobre a ancestralidade, transmissão e capacidades de um patógeno. Para bactérias não cultiváveis, essas informações só podem ser obtidas por meio do enriquecimento do alvo. O sequenciamento de patógenos bacterianos diretamente de amostras clínicas é um desafio devido ao DNA humano avassalador, à microbiota diversificada e às cargas bacterianas extremamente baixas.

Em muitos casos, a cultura não é uma opção, devido ao método de amostragem e bactérias exigentes. Ao aplicar essa tecnologia a bactérias sexualmente transmissíveis, descobrimos uma nova linhagem LGV de Chlamydia trachomatis chamada genótipo L4 ompA e confirmamos a expansão global da linhagem LGV dominante, fornecendo informações importantes para diagnóstico molecular e vigilância epidemiológica. Este protocolo de enriquecimento de progresso permite a recuperação completa do genoma de amostras clínicas de DST diagnosticadas positivas.

Descobrimos que essa técnica supera o sequenciamento metagenômico profundo, a depleção do DNA do hospedeiro e o sequenciamento adaptativo de nanoporos. Estamos investigando as cepas circulantes desses patógenos na Europa e na Argentina. Isso tem o potencial de informar sobre a transmissão e a administração de antimicrobianos.

Para começar, meça a concentração de DNA dos extratos de DNA de amostras clínicas usando um método sensível e preciso baseado em fluorescência. Dilua cada amostra de DNA usando água livre de nuclease para 10 a 200 nanogramas em um volume final de 17 microlitros em cada tira de tubo de PCR. Adicione 3 microlitros de mistura mestre de fragmentação a cada poço contendo os 17 microlitros de DNA diluído.

Pipete para cima e para baixo 20 vezes para misturar bem. Em seguida, sele a tira do tubo de PCR. Vortex a tira em alta velocidade por 10 segundos e gire brevemente para coletar o conteúdo.

Em seguida, coloque a tira de tubo de PCR no termociclador e inicie o protocolo pré-programado para fragmentação e incubação. Em seguida, prepare o reparo final e a mistura mestre de cauda dA, conforme mostrado na tabela. Vortex e gire o tubo como mostrado anteriormente e mantenha-o no gelo.

Em seguida, pipete 20 microlitros da mistura mestre de reparo final e rejeito de dA em cada poço contendo 50 microlitros de fragmentos de DNA. Sele a tira e o vórtice em alta velocidade por oito segundos. Depois de girar brevemente a tira, coloque-a de volta no termociclador.

Assim que o programa termociclador terminar, coloque a tira de tubo PCR no gelo. Em seguida, adicione 25 microlitros de master mix de ligação à temperatura ambiente, que foi preparado com 30 a 45 minutos de antecedência para cada poço contendo os fragmentos de DNA. Adicione 5 microlitros de mistura oligo adaptadora para bibliotecas marcadas com NBC a cada poço.

Coloque imediatamente a tira de tubo PCR de volta no termociclador e continue o programa. Para iniciar a purificação do DNA, recupere as esferas magnéticas de 4 graus Celsius e deixe-as atingir a temperatura ambiente antes de usar. Em seguida, adicione 80 microlitros a cada poço de amostra.

Coloque a tira do tubo PCR no suporte magnético e lave cada poço duas vezes com 200 microlitros de etanol a 70%. Aguarde um minuto durante cada lavagem e remova cuidadosamente o etanol sem perturbar as esferas magnéticas. Depois de misturar e incubar as esferas com 35 microlitros de água livre de nuclease por cinco minutos, aspire cuidadosamente o sobrenadante limpo de cada poço e transfira-o para um poço correspondente em uma nova tira de tubo de PCR.

Coloque a nova tira de tubo PCR no gelo e descarte as esferas magnéticas. Pegue a mistura de reação de PCR pré-recaptura preparada e adicione 11 microlitros dela em cada poço de amostra contendo a biblioteca de DNA purificada. Adicione 5 microlitros do reparo primário de índice selecionado a cada reação e sele a tira do tubo de PCR.

Inicie o programa de termociclador para amplificação de PCR conforme especificado na tabela para realizar a PCR de pré-captura. Adicione a tira de tubo PCR apenas quando o termociclador atingir 98 graus Celsius. Depois de concluir o PCR de pré-captura, execute outra limpeza baseada em bead para purificar a biblioteca.

Incube o produto de PCR com esferas magnéticas. Em seguida, coloque o tubo de tira de PCR em um dispositivo de separação magnética e aguarde de 5 a 10 minutos até que a solução fique clara. Enquanto a tira permanece no suporte magnético, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante transparente de cada poço.

Em seguida, elui o DNA em 15 microlitros de água livre de nuclease e meça a concentração de DNA da biblioteca de DNA purificada. Para hibridização de amostra, programe o termociclador de acordo com o protocolo especificado aqui. Inicie o programa e pause imediatamente a execução.

Diluir 500 a 1.000 nanogramas das bibliotecas de DNA preparadas até obter um volume final de 12 microlitros usando água livre de nuclease. Após o vórtice e a rotação da mistura de bloqueadores de oligonucleotídeos, adicione 5 microlitros a cada tubo de amostra. Sele a tira do tubo PCR e coloque-a no termociclador.

Pause o termociclador quando ele atingir a etapa três do protocolo. Adicione 13 microlitros da mistura de hibridização da sonda de temperatura ambiente preparada a cada amostra, mantendo a tira dentro do termociclador. Pipete lentamente para cima e para baixo 8 a 10 vezes para misturar.

Certifique-se de que não haja bolhas de ar e coloque a tira de volta no termociclador. Em seguida, confirme se todos os tubos estão bem fechados. Para capturar a biblioteca hibridizada, transfira todo o volume de cada tubo para os tubos correspondentes contendo 200 microlitros de grânulos de estreptavidina pré-lavados.

Recolha as esferas de estreptavidina antes de as lavar com tampão de lavagem à temperatura ambiente. Uma vez que a tira do tubo do PCR é removida do separador magnético, adicione 200 microlitros do tampão de lavagem de alta temperatura pre-aquecido a 70 graus Célsio e suspenda novamente os grânulos pipetando para cima e para baixo. Sele a tira do tubo, vórtice em alta velocidade e gire rapidamente, conforme demonstrado anteriormente.

Coloque a tira de tubo selada no bloco termociclador a 70 graus Celsius e incube por 5 minutos. Transfira a tira de tubo PCR do termociclador de volta para o separador magnético à temperatura ambiente. Aguarde um minuto até que a solução fique clara.

Em seguida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 25 microlitros de água livre de nuclease a cada tubo que contém as contas. Programe o termociclador conforme especificado na tabela mostrada aqui.

Adicione 25 microlitros da mistura de reação de PCR pós-captura preparada a cada tubo de amostra. Misture a reação até que a suspensão fique uniforme e sele firmemente a tira do tubo de PCR sem girá-la para baixo. Coloque a tira de tubo PCR selada no termociclador.

Depois de transferir o produto de PCR para um tubo novo, adicione 50 microlitros de suspensão de esferas a cada tubo de amostra e execute a limpeza do DNA conforme mostrado anteriormente. Medir a concentração de ADN do ADN final purificado da biblioteca utilizando um método de quantificação baseado em fluorescência. O enriquecimento do alvo resultou em porcentagens significativamente mais altas de leituras no alvo e, portanto, genomas completos em comparação com o sequenciamento direto em todos os patógenos testados, incluindo Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma Genitalium.

O sucesso do sequenciamento do genoma foi predominantemente observado em amostras com valores de limiar do ciclo qPCR abaixo de 30 para todos os quatro patógenos. Com uma clara correlação inversa entre os valores de TC e a porcentagem de leituras no alvo para Chlamydia trachomatis. Usando uma temperatura de hibridização de 62,5 graus Celsius em comparação com os 65 graus Celsius anteriores, melhorou a cobertura do genoma para mycoplasma genitalium sem reduzir o desempenho para os outros patógenos alvo.

A análise filogenética dos genomas de Chlamydia trachomatis da Argentina mostrou muitas amostras agrupadas dentro do clado L2b e revelou uma nova linhagem proposta como genótipo L4 ompA separada de todos os genomas LGV anteriores por aproximadamente 600 polimorfismos de nucleotídeo único.