Name: Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a gerar genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando enriquecimento alvo. Este protocolo supera o sequenciamento metagenômico profundo e possibilita vigilância genômica de patógenos de ISTs.

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<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
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<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
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<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
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<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>pipeta de 8 canais 0,5-10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000010</td><td>Eppendorf Research&nbsp; mais, 8 canais, 0.5-10 e micro; L, cinza médio, volume variável.</td></tr><tr><td>pipeta de 8 canais 10-100 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>Eppendorf Research&nbsp; mais, 8 canais, 10-100 e micro; L, amarelo, volume variável.</td></tr><tr><td>Adaptador Oligo Mix para bibliotecas marcadas com MBC</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de extração de ácido nucleico usando um kit de extração de DNA viral/patógeno</td><td>Qiagen</td><td>937036 (Kit) / 9001297 (Instrumento)</td><td>Instrumento QIAsymphony SP/AS usado com o QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit para extração automatizada de DNA.</td></tr><tr><td>Buffer de ligação</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte do kit de enriquecimento de alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (pós-PCR).</td></tr><tr><td>Kit de extração de DNA e instrumento automatizado</td><td>Corporação de Pesquisa Zymo</td><td>D3024/D3025</td><td>Kit Miniprep Quick-DNA usado para extração total de DNA de amostras clínicas. Compatível com fluxo de trabalho manual ou automatizado.</td></tr><tr><td>Reparo final - uma mistura de enzimas de rejeito</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Buffer de rejeito de reparo final</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>20816.298</td><td>Etanol absoluto &ge; 99,5% Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>Fluorômetro com ensaio de dsDNA de alta sensibilidade / método baseado em fluorescência para quantificar o DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Fluorômetro Qubit 4 com 1X dsDNA Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade (HS).</td></tr><tr><td>Buffer de fragmentação</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Parte do Kit de Fragmentação Enzimática SureSelect com o nome ''5X Fragmentation Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzima de Fragmentação</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Parte do Kit de Fragmentação Enzimática SureSelect.</td></tr><tr><td>Tampão DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do Kit de Preparação de Biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (Pré PCR) com o nome ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Tampão DNA polimerase de alta fidelidade com dNTPs (5X)</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte do Kit de Enriquecimento de Alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) com o nome ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzima de fusão de alta fidelidade para amplificação por PCR</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5191-5688</td><td>Parte do SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) com o nome ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem de alta temperatura</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte do Kit de Enriquecimento de Alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Pós-PCR) com o nome ''Tampão de lavagem 2''.</td></tr><tr><td>Buffer de Hibridização&nbsp;</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Primers de sequenciamento indexados</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte dos pares de primers de índice SureSelect XT HS2 de 1 a 96 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Ensaio interno de PCR multiplex em tempo real</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>Ensaio desenvolvido e credenciado internamente com base em kits Lightmix para detecção de DSTs</td></tr><tr><td>Tampão de ligação</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos para limpeza</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5191-5740</td><td>Contas SureSelect DNA AMPure XP.</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Material de laboratório permagen</td><td>MSRLV08</td><td>Separador Magnético de 8 Tiras PCR 0.2mL 5 &micro; L ~0.2mL Volume.</td></tr><tr><td>Sequenciamento de próxima geração (NGS): Sistema de sequenciamento de leitura curta de alto rendimento&nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>Sequenciamento de 150 pb de extremidade emparelhada (PE150) realizado nas plataformas Illumina NextSeq1000 e MiSeq.</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>BioConceito</td><td>3-07F04-H</td><td>Água para Biologia Molecular, livre de DNA/DNAse/RNase, estéril, livre de inibidores de PCR.</td></tr><tr><td>Mistura de Bloqueadores de Oligonucleotídeos</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Tira de tubo PCR</td><td>avantor, entregue pela VWR&nbsp; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>Tiras de tubos PCR com tampas planas anexadas.</td></tr><tr><td>Mistura de primer pós-captura</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte do kit de enriquecimento de alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (pós-PCR).</td></tr><tr><td>Sonda de RNA</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>Sonda SureSelect Custom Tier4 de 6 Mb a 11,9 Mb, por exemplo, ID do design S3465164).</td></tr><tr><td>Bloqueador de RNase</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem à temperatura ambiente</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) com o nome ''Wash buffer 1''.</td></tr><tr><td>Contas de estreptavidina</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5191-5742</td><td>Contas de Streptavidin SureSelect.</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR) .</td></tr><tr><td>Método de enriquecimento alvo / método de captura de DNA</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>G9983-90000</td><td>Kit de DNA SureSelect XT HS2 com preparação de biblioteca, enriquecimento de alvo Fast-Hyb e fluxo de trabalho de pool pós-captura. Versão do protocolo F0, maio de 2023. Para a plataforma Illumina NGS</td></tr><tr><td>Sonda de enriquecimento alvo definida para C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Laboratório de Microbiologia Enriquecedora (IMM, UZH)</td><td>ID do projeto S3465164</td><td>Conjunto de sondas com design personalizado (~242.000 sondas) para captura multiplex de quatro patógenos STI. Design baseado em múltiplos genomas de referência.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Thermofischer</td><td>4375305</td><td>Termociclador Veriti de 96 poços.</td></tr></tbody></table>

geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Um estudo sobre o surto de LGV de C. trachomatis em Buenos Aires, Argentina, mostrou algumas características novas nas amostras, a saber, 10 substituições de nucleotídeos no gene ompA em comparação com o genótipo ompA L1 e uma sequência incomum de tipagem de sequência multilocus (MLST) tipo 2 17,18,19. Nosso objetivo foi investigar os genomas dessas amostras clínicas, colocando-os no contexto de dados globais. Para conseguir isso, comparamos o desempenho de uma abordagem de enriquecimento alvo com sequenciamento metagenômico direto para WGS de DSTs bacterianas de amostras clínicas, na tentativa de superar os desafios impostos por baixas cargas bacterianas e DNA humano e microbiano abundante.
O DNA usado foi de amostras de swab retal coletadas entre 2017 e 2023 em Buenos Aires, Argentina, colocadas em meio 2-SP (meio sacarose-fosfato) suplementado com 2% de soro fetal de bezerro (FCS) e antibióticos (gentamicina 25 μg/mL, vancomicina 0,5 mg/mL e anfotericina B 2,5 μg/mL) e armazenados a -80 °C, ou uretral, anorretal, e swabs faríngeos coletados no Hospital Universitário de Zurique (USZ) em tampão NAATs (Testes de Amplificação de Ácido Nucleico). O DNA das amostras de Buenos Aires foi extraído usando um kit de extração manual à base de sílica, enquanto o DNA das amostras da USZ foi extraído usando um sistema automatizado baseado em esferas magnéticas.
Todas as amostras clínicas incluídas neste estudo foram confirmadas como positivas por um ensaio de PCR multiplex em tempo real desenvolvido internamente (ver Tabela de Materiais) com valores de limiar de ciclo de qPCR (Ct) variando da seguinte forma: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 e M. genitalium:  30-37. A concentração de DNA foi quantificada usando um ensaio fluorométrico de alta sensibilidade antes do sequenciamento para caracterizar o material de entrada das amostras clínicas (ver Tabela de Materiais).
Para comparar o sequenciamento metagenômico direto com o enriquecimento alvo, usamos 32 amostras, das quais 29 foram positivas para C. trachomatis, nove para N. gonorrhoeae, cinco para T. pallidum e três para M. genitalium. O sequenciamento metagenômico direto não resultou em genomas completos e, de fato, mal alcançou os dados alvo acima da linha de base observada em amostras negativas. O enriquecimento do alvo com hibridização a 65 ° C resultou em resultados muito melhores para cada patógeno, e genomas bem-sucedidos foram obtidos em muitos casos a partir desse método (Figura 1). 
Para avaliar a seleção ideal da amostra para enriquecimento do alvo, avaliamos a relação entre os valores de QPCR Ct de diagnóstico e a eficiência da recuperação do genoma, medida pela porcentagem de leituras no alvo (%OTR). Essa métrica reflete a proporção de leituras de sequenciamento que mapeiam o genoma do organismo alvo e é comumente usada para avaliar o desempenho do enriquecimento. Uma correlação significativa foi encontrada entre a carga do patógeno e o sucesso do sequenciamento para C. trachomatis, com um corte de Ct para sucesso em torno de Ct30. Embora os dados para os outros patógenos alvo tenham sido limitados, uma tendência semelhante foi observada, onde o sucesso do sequenciamento do genoma ocorreu predominantemente em amostras com carga de patógenos abaixo de Ct30 (Figura 2).
Este experimento com uma temperatura de hibridização de 65 °C deu taxas de sucesso de sequenciamento do genoma com enriquecimento alvo de 75% -80% para C. trachomatis, N. gonorrhoeae e T. pallidum, com base em amostras com valores de Ct abaixo de 30. As três amostras positivas para M. genitalium apresentaram valores de Ct de 30-37 e alcançaram menor cobertura do genoma e profundidade média de leitura. Para melhorar esses resultados, experimentamos reduzir a temperatura de hibridização, o que melhora a hibridização devido ao baixo teor de %G+C no genoma de M. genitalium . Usando temperaturas de hibridização mais baixas, como a temperatura agora recomendada de 62,5 ° C, podemos melhorar a recuperação de genomas de M. genitalium sem comprometer a recuperação de outros genomas (Figura 3). Esses resultados demonstram que o enriquecimento de alvos é uma abordagem eficaz para obter informações genômicas valiosas de amostras clínicas e pode ser adaptado a uma ampla gama de genomas, também em um projeto baseado em painel.
A análise filogenética dos genomas de C. trachomatis enriquecidos com sucesso mostrou que a maioria das amostras de Buenos Aires se agrupa dentro do clado L2b do genótipo ompA, sugerindo uma linhagem bem-sucedida com circulação global. A análise também revelou a presença de uma linhagem nova e distinta na Argentina, causando LGV. As amostras deste clado diferem em aproximadamente 600 SNPs das outras linhagens LGV, e esta linhagem é proposta como ompA-genótipo L4 (Figura 4). Uma descrição detalhada das amostras usadas na Figura 1, Figura 2 e Figura 4 é fornecida na Tabela Suplementar 1.
Essas descobertas ressaltam o valor do enriquecimento do alvo no estudo da diversidade de patógenos e demonstram um alto grau de sucesso no sequenciamento do genoma a partir de amostras clínicas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Figura 1: Enriquecimento de genomas usando enriquecimento alvo em comparação com sequenciamento metagenômico direto. A porcentagem de leituras no alvo (%OTR), definida como a porcentagem de leituras de sequenciamento mapeadas para o genoma do organismo alvo, mostra o grau de enriquecimento alcançado com o enriquecimento do alvo. A linha representa a mediana de todos os pontos de dados e a caixa indica o intervalo interquartil de 50% (IQR). As cores dos pontos de dados correspondem à fonte da amostra: azul claro para a Argentina e vermelho para a Suíça. O sucesso do sequenciamento do genoma, definido como cobertura &gt;95% e profundidade média de leitura &gt;10, é representado por pontos grandes, enquanto a falha é indicada por pontos pequenos. Observe as diferentes escalas no eixo y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Este número foi modificado de10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
Figura 2: Correlação de %OTR do enriquecimento alvo com valores diagnósticos de qPCR Ct. As cores dos pontos de dados representam a fonte da amostra: azul claro para a Argentina e vermelho para a Suíça. O sucesso do sequenciamento do genoma, definido como cobertura &gt;95% e profundidade média de leitura &gt;10, é indicado por pontos grandes, enquanto a falha é representada por pontos pequenos. Observe as diferentes escalas no eixo y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Este número foi modificado de10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
Figura 3: Efeito da temperatura de hibridização na recuperação de genomas completos em todos os patógenos bacterianos IST em dez amostras. O DNA humano na faixa do que em amostras clínicas foi enriquecido com concentrações conhecidas de DNA bacteriano alvo separadamente (único) e também para representar uma amostra com múltiplas infecções (agrupadas). Dois experimentos, cada um com os cinco patógenos/combinações, foram realizados: 0,01% e 0,03% para representar a porcentagem aproximada de DNA de cada microrganismo em relação ao DNA total da amostra (o DNA restante corresponde ao DNA humano). A recuperação de M. genitalium é melhorada em temperaturas mais baixas. C. trachomatis O DNA foi enriquecido em baixa concentração; experimentos posteriores mostram que as temperaturas não afetaram a recuperação dos genomas de C. trachomatis (dados não mostrados). Abreviaturas: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
Figura 4: Filogenia ajustada por recombinação de cepas LGV da Argentina. A análise inclui todos os genomas LGV disponíveis com dados publicados. Os metadados exibidos à direita da filogenia incluem amostras duplicadas de pacientes, Análise Bayesiana da Estrutura Populacional (BAPS; cluster = clado, com o cluster BAPS polifilético 6 representando a diversidade genética da população), método de sequenciamento do genoma (dados deste estudo), genótipo ompA , país e ano, conforme indicado na chave no canto superior esquerdo. Os dados ausentes são mostrados em branco. Os nomes do genoma deste estudo são destacados em azul claro para a Argentina e azul escuro para a Finlândia (não obtidos por enriquecimento alvo). Essas cores são usadas apenas para distinguir os genomas gerados neste estudo. Os valores de bootstrap de 1000 bootstraps ultrarrápidos são exibidos como porcentagens nas ramificações principais. Este número foi modificado de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar 1: Descrição dos materiais, reagentes, instrumentos e equipamentos utilizados no estudo. A tabela inclui informações detalhadas sobre o nome comercial, fabricante e número de catálogo dos componentes usados para extração de DNA, preparação de biblioteca, enriquecimento de alvo e sequenciamento. Também inclui itens usados para ensaios internos de qPCR e procedimentos gerais de biologia molecular. Alternativas equivalentes podem ser usadas para itens marcados com um asterisco (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

generating-whole-bacterial-genomes-from-clinical-samples-using-target

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Este protocolo detalha uma abordagem abrangente para a montagem de um genoma híbrido de bactérias urinárias. Fornece um procedimento reprodutível para a geração de sequências completas de genomas circulares úteis no estudo de elementos genéticos cromossômicos e extracromosômicos que contribuem para a colonização urinária, patogênese e disseminação de resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

A metaproteômica clínica oferece insights sobre o microbioma humano e suas contribuições para a doença. Aproveitamos o poder computacional da plataforma Galaxy para desenvolver um fluxo de trabalho de bioinformática modular que facilita a análise metaproteômica complexa baseada em espectrometria de massa e a caracterização de diversos tipos de amostras clínicas relevantes para estudos de doenças.

Um fluxo de trabalho de metaproteômica clínica implementado na plataforma Galaxy Bioinformatics para analisar as interações hospedeiro-microbioma subjacentes à doença humana

O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Aprenda a gerar genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando enriquecimento alvo. Este protocolo supera o sequenciamento metagenômico profundo e possibilita vigilância genômica de patógenos de ISTs.

Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

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