Imagens 3D de alta resolução e sem rótulos e análise de aprendizado de máquina de organoides intestinais por meio de holotomografia de baixa coerência

Nosso objetivo é estabelecer métodos de imagem em tempo real e sem rótulos ao monitorar mudanças biofísicas em organoides vivos durante o desenvolvimento e em resposta a medicamentos. Este protocolo facilita a escala simplificada de imagens e testes de drogas não invasivos em organoides vivos apoiados por mutação orientada por IA e seleção quantitativa de textura para pesquisa biomédica. Planejamos integrar ainda mais imagens 3D sem rótulos e uma análise de um ano para estudos de organoides não invasivos de alta resolução em modelagem de doenças e medicina precisa.

Para começar, aspire o meio gasto de cada poço de uma placa de 48 poços contendo a matriz extracelular. Adicione 200 microlitros de solução de recuperação celular a cada poço e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos. Usando uma pipeta, colete suavemente a suspensão organoide e transfira-a para um tubo de microcentrífuga.

Centrifugue o tubo a 150g por três minutos e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Para dissociar o pellet mecanicamente, ressuspendê-lo em 200 microlitros de meio de cultura e pipetar a suspensão para cima e para baixo 20 a 30 vezes usando uma pipeta P200 antes de centrifugá-la por três minutos. Após a centrifugação e remoção do sobrenadante, adicione matriz extracelular média e fresca, ou ECM, em uma proporção de um para quatro ao pellet e pipete suavemente para misturar bem.

Dispense 15 microlitros da mistura por cúpula em cada poço de uma placa de 48 poços. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por uma hora para permitir a polimerização do ECM. Após a polimerização, adicione 200 microlitros de meio de cultura fresco a cada poço e encha os poços externos vazios com PBS.

Para preparar a amostra para imagem, dispense 15 microlitros de cúpula de ECM organoide em uma placa de imagem de fundo de lamínula número 1,5 e incube-a em temperatura ambiente por um minuto. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, adicione delicadamente meio de cultura suficiente para submergir totalmente os organoides.

Cinco dias após a passagem, lave a amostra duas a três vezes com PBS imediatamente antes da imagem. Em seguida, para geração de imagens, ligue o controlador ambiental. A unidade controladora da câmara definirá automaticamente a temperatura para 37 graus Celsius e o dióxido de carbono para 5% Pressione o botão Porta para abrir a porta.

Adicione água para formar uma camada fina dentro do poço da câmara. Coloque o prato de imagem no suporte do recipiente, insira-o na câmara de imagem e prenda-o usando um pino para evitar movimento. Feche a porta para evitar interferência de luz externa.

Agora, inicie o software TomoStudio X e faça login. Clique em Iniciar para abrir a janela principal e, em seguida, clique em Adicionar Projeto no canto superior esquerdo e atribua o experimento. Confirme se o tipo de meio correto está selecionado para o uso apropriado do índice de refração.

Clique no poço desejado no painel e, em seguida, clique em Criar na parte superior para registrar o poço como uma amostra. Em seguida, clique em Configuração de ROI no canto superior direito para definir a região de interesse no prato. Depois de definido, clique em Executar experimento no canto inferior direito para abrir a janela Aquisição de imagem.

Clique em Carregar embarcação no canto para exibir uma imagem de campo claro. Ajuste a posição Z usando os botões Z e Z para focar a imagem. Na guia Imagem única, ajuste o tamanho do ROI.

Capture organoides em um campo de visão de 160 micrômetros por 160 micrômetros e adquira pilhas de até 140 micrômetros de profundidade. Navegue até a guia Time Lapse Imaging para configurar a imagem de longo prazo e definir a duração e o intervalo de tempo desejados. Clique no ícone Digitalizar para capturar o local atual do ROI.

Clique no botão BF para ajustar os valores de intensidade e exposição para imagens de campo claro. Mova a caixa ROI no painel Visualização para selecionar o ROI. Uma vez selecionado o ROI desejado, clique em Adicionar ponto na parte inferior, a lista de pontos de imagem será criada.

Agora, clique em Adquirir para iniciar a geração de imagens e adquirir os dados brutos da imagem. Inicie o HTX Processing Server clicando no ícone da área de trabalho. Arraste e solte arquivos de imagem bruta no HTX Processing Server.

Clique em Processo para gerar um arquivo TCF a partir do arquivo de imagem bruta. Inicie o TomoAnalysis Viewer clicando no ícone da área de trabalho. Carregue os arquivos TCF processados arrastando-os e soltando-os na janela do visualizador.

Clique duas vezes em uma miniatura de arquivo para abrir o tomograma de ROI. Examine a vista 2D navegando pelos planos X, Y, Z usando os controles de zoom, panorâmica e rolagem. Clique no ícone de visualização de renderização MIP à esquerda para alternar para o modo de renderização 3D.

Navegue pela visualização 3D girando, ampliando e deslocando a imagem. Para a segmentação de imagem baseada em aprendizado de máquina, exporte o arquivo de imagem TCF para o formato HDF5 para garantir que os dados estejam em um formato multidimensional, compatível com ilastik. Abra o ilastik e navegue até Novo projeto.

Selecione Classificação de pixels na seção Fluxo de trabalho de segmentação e salve o projeto em uma pasta designada. Para carregar o arquivo HGF5, navegue até a guia Dados de entrada, clique em Adicionar novo arquivo, selecione o conjunto de dados H5 apropriado e verifique as atribuições corretas de canal de imagem. Agora, navegue até a guia Seleção de recursos para escolher recursos como cor, intensidade, borda e textura para otimizar a segmentação.

Na guia Treinamento, rotule as regiões organoides e não organoides usando pinceladas de cores diferentes. Clique em Atualização ao vivo para visualizar os resultados da segmentação e fazer ajustes, se necessário. Uma vez feito isso, vá para a guia Exportação de previsão.

Selecione Segmentação simples como a origem para exportar previsões rotuladas e clique em Exportar tudo. Defina o formato de exportação como H5 ou TIFF com base nos requisitos de análise. Para a análise quantitativa, abra o Arquivo de codificação suplementar 2.

Designe os caminhos de pasta apropriados para o arquivo de máscara e o arquivo TCF correspondente dentro do script. Execute o código para iniciar a análise quantitativa. O código calculará o volume organoide, a densidade da proteína e o conteúdo total de proteína para cada conjunto de dados.

Esta figura ilustra as reconstruções tridimensionais de alta resolução do índice de refração usadas para visualizar a morfologia geral dos organoides do intestino delgado. As reconstruções renderizadas revelam diferenças estruturais distintas entre organoides tratados com veículo e tratados com cisplatina em todas as três profundidades de seção óptica. Os organoides tratados com cisplatina apresentaram volume significativamente maior, menor densidade de proteínas e maior teor de proteína total, em comparação com os organoides tratados com veículo 10 minutos após o tratamento, indicando inchaço estrutural precoce e composição proteica alterada.

A imagem de lapso de tempo ao longo de 24 horas mostrou que os organoides tratados com veículo mantiveram a integridade estrutural, enquanto os organoides tratados com cisplatina sofreram degradação estrutural progressiva, incluindo colapso da cripta e aumento da dissociação celular, sugerindo danos citotóxicos dependentes do tempo. O rastreamento quantitativo confirmou que os organoides tratados com veículo aumentaram em volume e conteúdo de proteína ao longo do tempo, enquanto os organoides tratados com cisplatina mostraram um declínio dependente do tempo em ambos os parâmetros, indicando que a cisplatina suprimiu o crescimento e induziu a degradação celular. A densidade de proteínas permaneceu estável em organoides tratados com veículo, mas diminuiu progressivamente em organoides tratados com cisplatina ao longo do período de 24 horas, sugerindo uma quebra na estrutura celular e aumento do espaço extracelular devido à esfoliação.