Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento

A infecção viral pode causar alterações significativas na infraestrutura celular. Para visualizar essas mudanças em três dimensões, utilizamos tomografia STEM para imagens de células infectadas pelo vírus. A tomografia STEM é demorada e trabalhosa.

Isso torna essencial a preparação ideal da amostra para amostras biológicas, como conjuntos infectados por vírus. A tomografia STEM convencional é limitada a doenças de amostra de aproximadamente 200 nanômetros. Nosso protocolo permite a obtenção de imagens 3D de seções mais grossas.

Isso permite uma visualização mais abrangente das células infectadas pelo vírus e das alterações ultra estruturais. Muitos vírus oncolíticos já são originalmente ensaios clínicos, portanto, pesquisadores e desenvolvedores ao redor do mundo trabalhando juntos, e a ciência está ultrapassando as fronteiras do tratamento do câncer, e métodos de ponta, como microscopia eletrônica e tomografia STEM, contribuem com novos insights. Continuaremos respondendo a perguntas virológicas utilizando tomografia STEM e combinando-a com novos protocolos de preparação e outras técnicas de microscopia.

Para começar, encha a caixa de LN com nitrogênio líquido em preparação para o manuseio e transferência dos discos de safira congelados do suporte de congelação de alta pressão ou HPF para as cápsulas de armazenamento. Mantenha um dewar cheio de nitrogênio líquido por perto para reabastecer a caixa LN conforme necessário durante o processo de congelamento. Mantenha uma pinça isolante pronta.

Prepare os recipientes de amostra que vão guardar os discos de safira após o HPF. Certifique-se de que tenham uma tampa e vários furos para o nitrogênio líquido despejar e pequenos pesos para garantir que não flutuem. Coloque o recipiente de etiquetas na caixa LN para pré-resfriar antes de usar.

Depois, coloque as amostras na incubadora. Inspecione os discos de safira sob um microscópio óptico invertido para garantir que há células suficientes e boa qualidade celular antes de iniciar o congelamento em alta pressão. Para realizar a HPF, pegue um disco de safira do recipiente de cultura e rapidamente o dalegue em papel filtrante para remover o excesso de mídia.

Coloque o disco no suporte HPF com o lado revestido a carbono voltado para cima, garantindo que o número dois seja legível. Mergulhe um espaçador dourado em hexadecano e coloque-o suavemente sobre o disco de safira. Posicione um segundo disco de safira sobre o espaçador com o lado revestido de carbono voltado para baixo para formar uma configuração sanduíche com as células apontadas uma para a outra, garantindo que não haja ar preso.

Feche o suporte do HPF com cuidado e rapidez para reduzir o estresse sobre a amostra. Insira o suporte HPF no freezer de alta pressão. Tranque-a conforme as instruções do fabricante e inicie o processo de congelamento.

Em seguida, transfira o suporte do HPF para a LN-box. Depois, transfira a ponta que carrega os discos de safira para a LN-box pré-resfriada. Extraia cuidadosamente os discos do suporte.

Coloque os frascos criogênicos fechados cheios de solução de substituição livre em um dispositivo de substituição livre pré-resfriado a menos 90 graus Celsius. Espere até que a solução atinja a mesma temperatura. Pré-resfrie pinças, bisturi e alicate ou pinças grandes mergulhando-as em nitrogênio líquido para uso na transferência dos discos de safira.

Transfira as amostras congeladas em alta pressão para o dispositivo de substituição livre. Separe os discos de safira um a um, mantendo-os em nitrogênio líquido. E transferir rapidamente cada disco individualmente para um frasco criogénico com solução de substituição livre, garantindo que o disco esteja totalmente imerso.

Após fechar o frasco criogênico, coloque-o imediatamente de volta no dispositivo de substituição livre. Uma vez que todas as amostras estejam colocadas, inicie o processo de substituição. Assim que as amostras atingirem 20 graus Celsius.

Continue lavando as amostras três vezes por 30 minutos cada com 100% de acetona. Para pré-embutida das amostras, incube-as em um terço de resina epóxi e dois terços de acetona por uma hora. Após incubar as amostras com dois terços de resina epóxi e um terço de acetona por uma hora, trocar a solução por resina epóxi 100% e incubar durante a noite com a tampa do frasco aberta para permitir a evaporação da acetona restante no dia seguinte, transferindo os discos de safira para novos tubos de reação marcados cheios de resina epóxi recém-preparada.

Posicione os discos horizontalmente apoiados pela parede do tubo, garantindo que o lado com as células fique voltado para cima. Depois, coloque os tubos de reação com as tampas abertas em um forno ajustado a 60 graus Celsius e deixe a resina polimerizar por pelo menos 48 horas. Após a polimerização da resina epóxi, imerga a ponta de um tubo de reação fechado em nitrogênio líquido por aproximadamente 10 segundos.

Toque o tubo de reação em uma mesa para liberar o bloco de resina. O disco de safira se separa facilmente da camada de carbono, que permanece presa às células embutidas. Selecione a região de interesse na amostra incorporada e reduza o tamanho da amostra à região de interesse.

Usando um ultra microtom com uma faca de diamante, colete seções com cerca de um micrômetro de espessura em uma grade de barra paralela carregada com poli-L-lisina para imagem STEM e tomografia STEM. Trate seções com ouro coloidal como marcadores fiduciários e aplique um revestimento de carbono. Após cortar e inspecionar seções ultrafinas, as amostras ficam prontas para imagem.

Com base na pergunta de pesquisa, insira o detector de campo brilhante, o detector de campo escuro, ou ambos. Ative o modo de varredura e adquira uma imagem de teste da amostra. Selecione uma ampliação maior que 800.000 vezes, que seja maior que a ampliação final desejada.

Perto da região de interesse, ajuste o foco e corrija o astigmatismo enquanto evite a exposição direta ao feixe nas áreas críticas da amostra. Defina a altura excêntrica para que a região de interesse, ou ROI, permaneça centralizada ao longo da faixa de inclinação. Escolha uma característica próxima ao ROI, leve para o centro, foque, corrija o astigmatismo e incline o palco passo a passo para menos 72 graus.

Para escolher o campo de visão, navegue de volta ao ROI, coloque-o em foco e capture uma imagem de visão geral. Defina a ampliação final desejada para aquisição da série de inclinação. Configure a aquisição automática em série por inclinação das imagens, variando de menos 72 graus a mais 72 graus e imagem a cada 1,5 grau.

Inicie a aquisição automática da série de inclinação. Fatias virtuais representativas do termograma STEM ilustraram como a orientação dos vírions impacta a visibilidade da forma característica da bala em vistas bidimensionais. Apenas virions alinhados paralelamente ao plano de visão apareciam com a morfologia completa e bem definida da bala, enquanto outros pareciam circulares ou alongados, dependendo do ângulo de inclinação.

Para superar as limitações de orientação da imagem 2D, a tomografia STEM foi usada para capturar grandes aglomerados de vírion do vírus da estomatite vesicular recombinante em brotação, permitindo a avaliação do formato do víon em três dimensões sem viés direcional. A vista lateral do termograma confirmou a vantagem volumétrica da tomografia STEM ao capturar muitos virions completos dentro de uma única seção de 600 nanômetros de espessura, em contraste com a amostragem limitada possível com uma seção TEM de 200 nanômetros.