Name: Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a realizar tomografia STEM em virologia usando congelamento de alta pressão e substituição por congelamento. Este protocolo permite imagens 3D detalhadas de células infectadas por vírus oncolíticos.

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<ol><li>Laue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+1+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 1 electron microscopy of viruses.</a> Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).</li>
<li>Goldsmith, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+electron+microscopy+for+identifying+viruses+in+diseases+of+unknown+cause%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause.</a> Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).</li>
<li>Guo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+electron+microscopy+in+virus+diagnosis+and+advanced+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches.</a> J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).</li>
<li>Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+cytomegalovirus+secondary+envelopment+by+advanced+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).</li>
<li>Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+HCMV+entry+into+host+cells+by+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography.</a> J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).</li>
<li>Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+replication+in+glioblastoma+cells%3A+electron+microscopic+tomography+shows+3D+arrangement+of+endoplasmic+reticulum%2C+replication+organelles%2C+and+viral+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins.</a> Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).</li>
<li>Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-native+visualization+of+SARS-CoV-2+induced+membrane+remodeling+and+virion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis.</a> Viruses. 14 (12), 2786(2022).</li>
<li>Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+infection+at+high+magnification%3A+3D+electron+microscopy+methods+to+analyze+the+architecture+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells.</a> Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).</li>
<li>Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-SEM+as+a+volume+electron+microscopy+approach+to+study+cellular+architectures+in+SARS-CoV-2+and+other+viral+infections%3A+a+practical+primer+for+a+virologist%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist.</a> Viruses. 13 (4), 611(2021).</li>
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<li>Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STEM+tomography+of+high-pressure+frozen+and+freeze-substituted+cells%3A+a+comparison+of+image+stacks+obtained+at+200+kV+or+300+kV%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV.</a> Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).</li>
<li>Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+STEM+tomography+at+200+kV%3A+setup%2C+performance%2C+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations.</a> J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).</li>
<li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+transmission+electron+microscopy%3A+preparation+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+imaging+techniques%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell imaging techniques, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).</li>
<li>Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+preparation+by+high-pressure+freezing%2C+microwave-assisted+contrast+enhancement%2C+and+minimal+resin+embedding+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging.</a> J Vis Exp. (145), e59156(2019).</li>
<li>Read, C., Walther, P., von Einem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegaloviruses%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegaloviruses, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).</li>
<li>Romero-Brey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+organelles+in+situ+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography.</a> J Vis Exp. (196), (2023).</li>
<li>McDonald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+28+%26%2334%3Btips+and+tricks%26%2334%3B+for+high-pressure+freezing+of+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 28 &#34;tips and tricks&#34; for high-pressure freezing of model systems.</a> Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+chemical+fixation+procedures+with+high-pressure+freezing+and+freeze+substitution+preserves+highly+labile+tissue+ultrastructure+for+electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications.</a> J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+enhancing+EF-C+peptide+nanofibrils+are+endocytosed+by+macropinocytosis+and+subsequently+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded.</a> Biomaterials. , 317(2025).</li>
<li>Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+H7-protein+is+required+for+the+organization+of+the+viral+scaffold+protein+into+hexamers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers.</a> Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).</li>
<li>Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB%2FSEM+tomography+with+TEM-like+resolution+for+3D+imaging+of+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells.</a> Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).</li>
<li>Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Golgi+apparatus+and+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+the+SARS-CoV-2+replication+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex.</a> Viruses. 13 (9), 1798(2021).</li>
<li>Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+%28S3EM%29+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).</li>
<li>Lewczuk, B., Szyryńska, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-emission+scanning+electron+microscope+as+a+tool+for+large-area+and+large-volume+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies.</a> Animals. 11 (12), 3390(2021).</li>
<li>Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mitochondrial+ultrastructure+of+Drosophila+indirect+flight+muscle+revealed+by+serial-section+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography.</a> J Vis Exp. (130), e56567(2017).</li>
<li>Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+structural+and+functional+model+of+the+coronavirus+replication+organelle%3A+tracking+down+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Biol%22%5BJournal%5D)">A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis.</a> PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).</li>
<li>Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+three-dimensional+architecture+of+the+dengue+virus+replication+and+assembly+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites.</a> Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).</li>
<li>Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+Zika+virus+replication+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories.</a> Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).</li>
<li>Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+infection+cycle+of+VSV-%CE%94G-spike+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus.</a> Viruses. 14 (12), 2828(2022).</li>
<li>Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+permanganate+is+an+excellent+alternative+to+osmium+tetroxide+in+freeze-substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution.</a> Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1-Hexadeceno</td><td>Merck KGaA</td><td>8220640500</td><td></td></tr><tr><td>200 grade de cobre com barras paralelas</td><td>Plano GmbH</td><td>G2014C</td><td></td></tr><tr><td>37 & deg; Câmara de secagem C</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0323</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR international GmbH</td><td>20066330</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>Faca de diamante</td><td>Diatome Ltd</td><td>https://www.diatomeknives.com/ultra-35</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812 Resina</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de EM</td><td>TVIPS GmbH</td><td>Software TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00983.2511</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>VWR international GmbH</td><td>516-0812</td><td></td></tr><tr><td>Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mL</td><td>VWR international GmbH</td><td>548-0625</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>15830-25</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de substituição por congelamento Leica EM AFS2</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/</td><td></td></tr><tr><td>Glod Sol 25 milhas náuticas</td><td>Reagentes e Reagentes de Ouro da AURION Immuno Acessórios</td><td>425.011</td><td></td></tr><tr><td>Broca de pinheiro dourado e oslash dourado; 2000 & mu; m</td><td>Science Services GmbH</td><td>GA2000-Au</td><td></td></tr><tr><td>Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupfer</td><td>Plano GmbH</td><td>NH6C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>MEDAX GmbH & Co. KG</td><td>12501</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de vaporização de alto vácuo BAF 300</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer de alta pressão Wohlwend HPF Compact 01</td><td>Escritório de Engenharia M. Wohlwend GmbH</td><td>https://www.wohlwend-hpf.ch/index.html</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio líquido</td><td>H.Erben GmbH</td><td>94500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio (fluido)</td><td>VWR international GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>ChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH</td><td>006051</td><td></td></tr><tr><td>Forno a 120 &deg; C</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0194</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easi-Glow</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysina 0,1% em relação a algo. Solução</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18026</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 0,5 mL</td><td>Eppendorf SE</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de amostra (cápsulas Beem)</td><td>Plano GmbH</td><td>G360-1</td><td></td></tr><tr><td>Diâmetro do disco de safira 3 x 0,16 mm</td><td>Escritório de Engenharia M. Wohlwend GmbH</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Riedel de Ha&euml; n AG</td><td>31697</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de luz UV</td><td>Dinies</td><td>ELG100S</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura em virologia: imagem 3d de amostras congeladas de alta pressão e substituídas por congelamento

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Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas.

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Aqui, é apresentado um protocolo descrevendo as etapas de preparação da amostra e coleta de dados necessárias na tomografia criobada de raios-X (SXT) para a imagem da ultraestrutura de células inteiras preservadas de crio-preservo em uma resolução de 25 nm meio passo.

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Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.

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