Cartografia Molecular de Modalidade Dupla: Integrando a Detecção de RNA Multiplex com a Citometria de Massa por Imagem de Proteínas
14 de novembro de 2025
Este protocolo detalha uma metodologia para detecção de mRNA multiplex com citometria de massa de imagem de proteína em seções de tecido embebidas em parafina fixada em formalina.
Focamos em biologia especial para compreender melhor os mecanismos moleculares do câncer de ovário, na esperança de encontrar novos alvos terapêuticos e biomarcadores para prever a sobrevivência dos pacientes. Um dos desafios atuais da IMC inclui a dissecação de proteínas de menor abundância, o trabalho de validação e titulação de anticorpos, bem como a classificação de pixels complexa e demorada durante a análise. Comece removendo o excesso de líquido das lâminas preparadas de FFPE.
Tire a bandeja de controle de umidade do forno e coloque o suporte do ferrolho na forma. Depois, faça vórtice RNA-ISH Amplifier 3 e adicione reagente suficiente para cobrir completamente cada seção de tecido nas lâminas. Feche a bandeja e insira no forno de hibridização por 30 minutos a 40 graus Celsius.
Durante a incubação, prepare a mistura metálica de oligonucleotídeos diluindo cada oligômetro em uma proporção de um para 15. Misture bem o metal com o oligo metálico e deixe em temperatura ambiente até o uso adicional. Agora, retire a bandeja de controle de umidade do forno.
Tire o suporte do ferro-lâmino da bandeja e coloque a bandeja de volta no forno. Depois, coloque as lâminas em um suporte transparente que tenha sido pré-lavado com água sem nuclease. Lave os slides no buffer de lavagem sob leve agitação por dois minutos.
Depois de remover o excesso de líquido das lâminas, tire a bandeja de controle de umidade do forno e coloque o suporte do lâmino na forma. Adicione os oligonucleotídeos metálicos mistos preparados anteriormente para cobrir completamente cada seção de tecido. Agora, feche completamente a bandeja e insira-a no forno de hibridização por 45 minutos a 40 graus Celsius.
Retire a bandeja de controle de umidade do forno de hibridização, retire o suporte do ferrolho e devolve a bandeja vazia ao forno. Para bloquear os sítios de ligação inespecíficos, adicione um volume suficiente de tampão bloqueante para cobrir completamente cada seção de tecido na lâmina e incube as lâminas em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto as lâminas estão incubadas, prepare a mistura de anticorpos diluindo os anticorpos usando o tampão diluente de anticorpos.
Após a incubação, descarte o tampão das lâminas de tecido e dispense quantidade suficiente da mistura de anticorpos previamente preparada para cobrir completamente as seções do tecido. Depois, coloque as lâminas em uma câmara de umidade e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius. Para preparar uma solução fresca de intercalador de irídio, faça uma diluição de um para 2.000 a partir de uma solução de estoque de 500 micromolares usando TBS livre de RNase.
Coloque as lâminas em um suporte transparente que tenha sido pré-lavado com água sem nuclease, e lave as lâminas no tampão TBS-T usando uma leve agitação por cinco minutos. Depois, para tingir as lâminas, adicione a solução de trabalho de irídio preparada e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois disso, coloque as lâminas em um suporte transparente que tenha sido pré-lavado com água livre de nuclease.
Lave as lâminas duas vezes no buffer TBS-T com leve agitação por cinco minutos. Depois, mergulhe rapidamente as lâminas em água duplamente destilada para evitar a cristalização do sal causado pelo TBS no tecido. Seque as lâminas sob um capuz químico por 10 minutos e armazene-as a quatro graus Celsius até a aquisição da imagem.
Carregue a lâmina preparada na câmara de ablação do sistema de citometria de massa por imagem. Capture uma imagem panorâmica do slide para identificar a região de interesse. Usando o software de aquisição de imagem, marque as regiões de interesse desejadas na imagem panorâmica.
Aplique o modelo de aquisição no software de aquisição de imagem. E ajuste a potência do laser com base no tipo de amostra. Agora, comece o processo de ablação a laser.
Meça a quantidade de cada isótopo usando o detector, que converte os dados em formato digital para análise. O status de ativação das células T CD8 foi avaliado usando co-detecção da granzima B tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína, juntamente com positividade interferon-gama. Um fibroblasto associado ao câncer demonstrou expressar a proteína MFAP5 e o mRNA POSTN, ambos marcadores da agressividade dos fibroblastos associados ao câncer.
Uma célula T CD4 demonstrou co-expressar o mRNA IL17A e IL6, consistente com a identidade da célula TH17. Células T CD4 foram observadas expressando mRNA IL13. Células tumorais CD47-positivas para queratina foram observadas próximas a uma célula T CD8.
Uma célula T CD8 ativada demonstrou expressar proteína CD25. Coloração comparável por mRNA de THBS2 e CD47 foi observada entre protocolos conjugados com metais e marcados com fluorescência.
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Visão Geral
Este protocolo detalha uma metodologia para detecção multiplex de mRNA com citometria de massa por imagem de proteínas em cortes de tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina. O foco está em compreender os mecanismos moleculares do câncer de ovário para identificar novos alvos terapêuticos e biomarcadores.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Oncologia
Antecedentes
- Compreensão do câncer de ovário em nível molecular.
- Dificuldades na detecção de proteínas de menor abundância.
- Necessidade de validação e titulação de anticorpos.
- Complexidade da classificação de pixels durante a análise.
Objetivo do Estudo
- Encontrar novos alvos terapêuticos para o câncer de ovário.
- Identificar biomarcadores que predizem a sobrevida do paciente.
- Aprimorar metodologias para detecção de proteínas em amostras de tecido.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas de FFPE.
- Uso de bandejas de controle de umidade para hibridização.
- Aplicação do reagente Amplificador de RNA-ISH 3.
- Hibridização em temperatura controlada.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de mRNA multiplex e proteínas.
- Metodologia aprimorada para análise de cortes de tecido.
- Informações sobre os mecanismos moleculares do câncer de ovário.
- Potencial para identificar novos biomarcadores.
Conclusões
- O protocolo aprimora a compreensão da biologia do câncer de ovário.
- Ele aborda os desafios na detecção de proteínas.
- Ele estabelece as bases para futuros desenvolvimentos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A integração da detecção multiplex de mRNA com a citometria de massa por imagem de proteínas permite o perfilamento espacial simultâneo de transcriptômica e proteômica em uma única seção de tecido, avançando o desvio de risco mecanicista e a validação de alvos na descoberta oncológica. Essa abordagem de dupla modalidade supera as limitações da detecção exclusivamente por anticorpos e do derramamento espectral fluorescente, proporcionando maior confiança preditiva na identificação de biomarcadores e alvos terapêuticos. O método apóia decisões de portfólio ajustadas ao risco ao fornecer informações moleculares quantitativas e resolvidas espacialmente, essenciais para a descoberta precoce e a pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a correlação direta da expressão de mRNA e proteína dentro do mesmo microambiente celular.
- Apóia a validação funcional de alvos ao revelar tanto o preparo transcricional quanto a sinalização ao nível da proteína.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer a atividade da via e o estado celular em tecidos relevantes para a doença.
- Melhora a confiança preditiva para a priorização de alvos candidatos e biomarcadores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de tecidos multiplexados e validados para triagem subsequente e avaliação de compostos.
- Fornece resultados quantitativos e reproduzíveis para analitos de mRNA e proteínas in situ.
- Reduz a redundância de ensaios ao integrar a detecção de analitos em um único fluxo de trabalho.
- Minimiza os requisitos de pós-processamento e compensação em comparação com métodos baseados em fluorescência.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha o perfil molecular espacial com a arquitetura tecidual relevante para a descoberta translacional de biomarcadores.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, suportando leituras multiplexadas com resolução espacial.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo dados robustos e multi-analíticos provenientes de amostras clinicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho de dupla modalidade integra a descoberta inicial, a validação de alvos e a pesquisa translacional, permitindo uma cartografia molecular abrangente em cortes de tecido FFPE.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao mapear a coexpressão de mRNA e proteína in loco.
- Triagem: Fornece seções de tecido multiplex prontas para ensaios, com resultados quantitativos para avaliação posterior.
- Análises: Gera medições digitais baseadas em isótopos para comparação estatística robusta de fenótipos celulares.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e a validação relevante para doenças em microambientes teciduais complexos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e reutilizável para perfis espaciais multiparamétricos em portfólios de oncologia e imunologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na descoberta de alvos e biomarcadores.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de detecção multiplex e minimiza artefatos técnicos decorrentes de limitações de fluorescência ou de anticorpos.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais informadas de prosseguir/interromper e a triagem eficiente de portfólios com base em dados moleculares robustos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos e biomarcadores de alta confiança.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de massa por imagem e técnicas de hibridização in situ.
- Exige acesso a instrumentação especializada para detecção baseada em sondas metálicas e análise digital.
- Necessita de rigorosa validação de anticorpos e sondas para garantir especificidade e sensibilidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de tecidos ou modelos de doenças, conforme a abundância do analito e a arquitetura tecidual.
- A complexidade da análise aumenta com maior plexidade e resolução espacial, exigindo ferramentas computacionais avançadas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
0:32
Hybridizing RNA-ISH Amplifier 3 to Ovarian Cancer FFPE Sections
1:47
Hybridizing Metal Oligos to the Tissue Sections
2:30
Hybridizing Metal Conjugated Antibodies to the Tissue Sections
3:20
DNA Staining to Prepare Tissue Sections for Imaging
4:33
Image Acquisition
5:35
Results
