Name: Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a detectar e quantificar microRNAs e proteínas simultaneamente em tecido FFPE usando hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado. Este método preserva a integridade tecidual e permite a localização espacial no microambiente tumoral.

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<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers. 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+in+cancer%3A+The+involvement+of+aberrant+microrna+biogenesis+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways.</a> Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).</li>
<li>Peng, Y., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in human cancer.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).</li>
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<li>Juźwik, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+dysregulation+in+neurodegenerative+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review.</a> Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).</li>
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<li>Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+exosomal+miRNA+biosensing+for+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy.</a> Molecules. 27 (21), 7145(2022).</li>
<li>Farrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+circulating+miRNAs+in+bovine+serum+and+their+potential+as+novel+biomarkers+of+early+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection.</a> PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).</li>
<li>Aparicio-Puerta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srnabench+and+srnatoolbox+2022+update%3A+Accurate+mirna+and+sncrna+profiling+for+model+and+non-model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms.</a> Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).</li>
<li>Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirdeep2+accurately+identifies+known+and+hundreds+of+novel+microRNA+genes+in+seven+animal+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades.</a> Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).</li>
<li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtarbase+2016%3A+Updates+to+the+experimentally+validated+miRNA-target+interactions+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database.</a> Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+miRNAs+and+gene-specific+mRNA+at+the+single-cell+level+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry.</a> Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).</li>
<li>Eichert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+an+%27all+locked%27+nucleic+acid+duplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex.</a> Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).</li>
<li>Viratham Pulsawatdi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+multiplex+immunofluorescence+and+digital+pathology+workflow+for+the+characterisation+of+the+tumour+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment.</a> Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).</li>
<li>Janati-Idrissi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+a+needle+in+a+haystack%3A+De+novo+phenotypic+target+identification+reveals+hippo+pathway-mediated+mir-202+regulation+of+egg+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production.</a> Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x SALO com TIS bufferizado (TBS) pH 7,6&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; J62662&nbsp; K7</td><td>Para lavagens intermitentes entre etapas</td></tr><tr><td>1x Diluente/Bloqueio de Anticorpos Opal/nbsp;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1001EA</td><td>Solução bloqueadora de proteínas</td></tr><tr><td>Diluente de Amplificação de Automação 1x Plus</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1609</td><td>Usado para diluir fluoróforos de opala</td></tr><tr><td>20x Concentrado&nbsp; Tamponador de Citrato de Sódio Salino (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td>Para lavagens de miRNA após hibridização com sonda</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>EN62248 / 62248</td><td>Para coloração nuclear</td></tr><tr><td>Sistema de Hibridização ACD HybEZ II</td><td>ACD Biotechne</td><td>321711</td><td>Forno usado para regular a temperatura durante o protocolo miRNAscope</td></tr><tr><td>Anti-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAb</td><td>Tecnologias de Sinalização Celular</td><td>85336S</td><td>Exemplo de anticorpo primário usado para otimizar esse protocolo</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina (Mouse) HRP conjugado</td><td>Revvity Health Sciences Inc</td><td>NEF832001EA</td><td>Reagente secundário usado para detecção de miRNA</td></tr><tr><td>Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAb</td><td>Tecnologias de Sinalização Celular</td><td>93790</td><td>Exemplo de anticorpo primário usado para otimizar esse protocolo</td></tr><tr><td>Pó de Reagente de Bloqueio</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1012</td><td>Solução bloqueadora de miRNA</td></tr><tr><td>Álcool Etílico 100% (200 Proof)</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>Para a desparafinização</td></tr><tr><td>EZ-AR1 Buffer</td><td>BioGeneX</td><td>HK521-XAK</td><td>Usado para coleta de antígeno em seções de tecido FFPE na etapa proteica</td></tr><tr><td>EZ-AR1 Elegance Buffer</td><td>BioGeneX</td><td>HK546-XAK</td><td>Usado para coleta de antígenos em seções de tecido FFPE na etapa da sonda de miRNA</td></tr><tr><td>Sistema IR EZ-Retriever</td><td>BioGeneX</td><td>MW015-IR</td><td>Micro-ondas usado para coleta de antígenos em seções de tecido FFPE</td></tr><tr><td>Solução de Água Oxigenada 30%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>HX0640-5&nbsp;</td><td>Para preparação de lenços. Ajuda a bloquear a atividade endógena da peroxidase e a produzir produtos altamente coloridos</td></tr><tr><td>Sonda de miRNA miR-181c-3p</td><td>Qiagen</td><td>339112</td><td>Exemplo de sonda de miRNA usada para otimizar esse protocolo</td></tr><tr><td>Conjunto de Buffer de miRNA miRNA miRCURY (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450&nbsp;</td><td>Usado para diluir a sonda de miRNA</td></tr><tr><td>Opal 620</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1495001KT</td><td>Fluoróforo para identificar anticorpos primários</td></tr><tr><td>Opal 690&nbsp;</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1497001KT</td><td>Fluoróforo para identificar anticorpos primários</td></tr><tr><td>Opal Anti-Ms + Rb HRP</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>Anticorpo secundário usado como agente de detecção</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeído (w/v), Livre de Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Produzir 3,7% de PFA para preparação de tecidos</td></tr><tr><td>Antidesfaçamento de Diamante ProLong</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Mídia de montagem</td></tr><tr><td>RNAscope Protease Plus</td><td>ACD Biotechne</td><td>322331</td><td>Para permeabilizar seções de tecido &nbsp; digerindo parcialmente proteínas & expor moléculas de miRNA alvo</td></tr><tr><td>Água livre de RNAse &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CM&nbsp;</td><td>Limpar e preparar todo o equipamento, e usar como diluiente quando necessário &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td>Para fazer o TBS-T</td></tr><tr><td>Amplificação do Sinal de Tiramida Mais Cianina 3</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>NEL744001KT</td><td>Fluoróforo para identificar miRNA</td></tr><tr><td>Sondas de miRNA U6 e Scramble</td><td>Qiagen</td><td>339459</td><td>Sondas de controle opcionais</td></tr><tr><td>Grau histológico dos xilenos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1307</td><td>Para a desparafinização</td></tr></tbody></table>

amplificação e reconhecimento de microrna por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

MicroRNA Amplification and Recognition through Locked-nucleic-acid In situ Hybridization as a Novel Detection and Quantification Method

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

When using traditional probe-based in situ hybridization (ISH) imaging detection methods, microRNAs (miRNAs) are difficult to capture due to their size, ...

microrna-amplification-recognition-through-locked-nucleic-acid-situ

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Um método high-throughput romance é descrito que permite a detecção e quantificação relativa de RNA pequeno e expressão do RNAm da única células bacterianas usando bloqueado sondas de ácidos nucléicos e citometria de fluxo por...

Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

Este vídeo descreve uma estratégia de hibridização sequencial que envolve a hibridização de sondas de mRNA para mRNA alvo específico. Após a hibridização da sonda, a amplificação do sinal é realizada para melhorar a resolução por meio da redução da relação sinal-ruído durante o RNA-CISH de amostras histológicas.

Hibridização de sonda e amplificação de sinal em hibridização in situ de RNA: uma técnica para detectar sequências específicas de RNA em seções de tecido

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe amplamente conservada de moléculas reguladoras. Aqui descrevemos um método de clonagem de miRNA que se baseia em duas etapas de ligação potentes seguidas de sequenciamento de alto rendimento. Nosso método permite a quantificação precisa de miRNAs em todo o genoma.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Aqui apresentamos um protocolo para detectar a expressão de miRNAs em amostras de pacientes com câncer de mama usando hibridização in situ de miRNA.

Análise clínico-patológico de miRNA Expressão em cancro da mama tecidos usando miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aprenda a detectar e quantificar microRNAs e proteínas simultaneamente em tecido FFPE usando hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado. Este método preserva a integridade tecidual e permite a localização espacial no microambiente tumoral.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação (Vídeo) | JoVE Journal

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