Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

O escopo da nossa pesquisa foi desenvolver e validar um ensaio que simultaneamente detecte e quantifique microRNAs e múltiplas proteínas dentro do tecido FFPE, para melhor observar espacialmente a relação entre ambos dentro da TME. Na verdade, ele supera limitações comuns do sequenciamento molecular existente e do tradicional ao fornecer uma quantificação direta, colocalização e detecção espacial simultânea de microRNAs e proteínas, tudo isso sem destruir o tecido e preservar a localização celular e subcelular. Essa tecnologia potencialmente abre caminho tanto para pesquisas básicas em redes regulatórias, mecanismos de doenças quanto para estudos translacionais ou clínicos buscando melhores biomarcadores e alvos terapêuticos.

Comece retirando amostras fixadas com formalina, com parafina, do tumor ovariano humano, mantidas durante a noite a 60 graus Celsius. Utilizando água sem RNAse, limpe todos os equipamentos e ferramentas cuidadosamente. Em seguida, para realizar a desparafinização, imerga as amostras em xileno três vezes por cinco minutos cada.

Reidrate os tecidos com 10 rodadas sequenciais de etanol diluído, cada uma por três minutos. Depois, lave as amostras uma vez em TBS por dois minutos. Aplique uma solução de peróxido de hidrogênio a 3% nas amostras por 10 minutos.

Lave as amostras duas vezes por dois minutos cada com TBS. Depois, aplique uma solução de paraformaldeído a 3,7% por 10 minutos. Depois disso, inicie a primeira rodada de coleta de antígenos usando o sistema infravermelho Easy Retriever.

Submerga as lâminas em um novo buffer EZ-AR 1 e aqueça no micro-ondas a 95 graus Celsius por 15 minutos. Depois, enxágue as amostras em TBS por dois minutos, seguido de duas lavagens de dois minutos em TBST. Para começar, desenhe uma barreira ao redor de cada seção de tecido usando uma caneta de barreira hidrofóbica.

Adicione solução bloqueadora de anticorpos e incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara de umidade. Agora, aplique o anticorpo primário diluído na mesma solução bloqueante para cobrir totalmente a seção do tecido e incube por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara de umidade. Após lavar as lâminas três vezes em TBST, adicione a solução anti-rato e a solução de peroxidase de raiz-forte para cobrir o tecido e incubar na câmara de umidade em temperatura ambiente por 10 minutos.

Agora, dilua o primeiro fluoro-4 em uma proporção de 1:100 com diluente de amplificação. Aplique essa mistura ao tecido e incube por 10 minutos em temperatura ambiente em uma câmara de umidade, evitando exposição direta à luz. Após realizar a segunda rodada de coleta e bloqueio de antígenos, como mostrado anteriormente, dilua o segundo anticorpo primário com a mesma solução bloqueante.

Aplique o anticorpo diluído para cobrir toda a seção do tecido e incube durante a noite por pelo menos 16 horas a quatro graus Celsius dentro de uma câmara de umidade. No dia seguinte, lave as lâminas três vezes por dois minutos cada em TBST e incube com solução anti-raiz-forte e solução de peroxidase de raiz-forte de coelho, como mostrado anteriormente. Depois, aplique o segundo fluoro-4 diluído nas lâminas e incube por 10 minutos em temperatura ambiente na câmara de umidade.

Para a aplicação da sonda, lave os slides três vezes por dois minutos cada em TBST. Para iniciar a terceira e última coleta de antígeno, submerga as lâminas em um buffer EZ-AR 1 Elegance e caleça no micro-ondas a 107 graus Celsius por 15 minutos. Resfrie as lâminas em temperatura ambiente por 20 minutos antes de lavá-las uma vez por três minutos em colher de sopa.

Aplique RNAscope Protease Plus suficiente para cobrir a área do tecido e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos usando um forno. Depois, aqueça a sonda de ácido nucleico bloqueada por microRNA a 90 graus Celsius por quatro minutos para desnaturalizá-la. Dilua imediatamente a sonda desnaturada com um tampão de hibridização in situ de microRNA.

Após fazer vórtice e girar a sonda preparada, adicione-a para cobrir toda a área do tecido e incube por uma hora a 60 graus Celsius no forno. Lave os slides uma vez por cinco minutos em 5x SSC Buffer. Realize cinco lavagens rigorosas a 60 graus Celsius usando SSC Buffer por cinco minutos cada.

Depois, lave as lâminas uma vez por cinco minutos em 0,2 vezes SSC em temperatura ambiente. Para preparar o tampão de bloqueio, combine TBS e pó de reagente bloqueante de 0,5%. Aplique o tampão bloqueador e incube por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.

Em seguida, aplique anti-digoxina e conjugado de peroxidase de raiz-forte, e incube por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Após três lavagens TBST, aplique diluição 1:50 da amplificação do sinal de tiramida mais cianina 3 nas lâminas por 10 minutos em temperatura ambiente em uma câmara de umidade. Lave os slides mais três vezes por cinco minutos cada no TBST.

Aplique solução de trabalho DAPI suficiente diluída 1:1000 em TBS para cobrir totalmente a seção de tecido. Incube as lâminas por cinco minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada com umidade ambiente. Lave os slides três vezes por cinco minutos cada em TBST.

Aplique as lâminas de cobertura usando material de montagem e deixe as lâminas secarem por 10 minutos em temperatura ambiente. Armazene as lâminas secas a quatro graus Celsius no escuro por 24 a 72 horas antes da imagem ou até três meses para armazenamento a longo prazo. A expressão de miRNA de miR-181c-3p foi consistentemente detectada tanto em lâminas controle quanto coloridas por anticorpos, com sinais visivelmente mais fortes concentrados nas regiões das células tumorais.

A aplicação do anticorpo anti-EpCAM com um fluoróforo de emissão de 620 nanômetros coloriu as células tumorais na amostra de HGSC. Aplicação do anticorpo anti-CD8 com fluoróforos de emissão de 620 nanômetros marcados claramente como células T CD8 positivas. A detecção combinada de proteínas e miRNA permitiu a localização espacial do miR-181c-3p em relação a células tumorais positivas para EpCAM e células imunes CD8-positivas.

A sonda controle positiva, direcionada ao RNA nuclear pequeno U6, produziu sinais fluorescentes fortes em todos os tipos de tecidos, confirmando a eficácia e integridade dos tecidos da sonda. A sonda controle negativa, que usou uma sequência de miRNA embaralhado, não mostrou sinal detectável em nenhum tipo de tecido, indicando que não houve ligação inespecífica. A sonda alvo para miR-181c-3p mostrou forte expressão no tecido do carcinoma seroso de alto grau, sem sinal no tecido ovariano normal ou no tecido normal da trompa de Falópio, demonstrando a especificidade e precisão da sonda e do ensaio.