Determinação estrutural de hemaglutinina de resolução subnanométrica a partir de tomografia crioeletrônica de vírus influenza

Nosso laboratório utiliza biologia estrutural para estudar vírus e a evolução da resistência a medicamentos. No trabalho atual, estamos caracterizando como a hemaglutinina da influenza altera a conformação ao se ligar aos receptores. Utilizamos a criotomografia eletrônica para visualizar a morfologia viral, a organização e a estrutura.

Especificamente, usamos essa modalidade de criomicroscopia eletrônica para obter imagens do vírus pleomórfico da gripe. Nosso protocolo nos permite estudar a organização e a estrutura da hemaglutinina da influenza in situ em vírus intactos com resolução subnanômetro. Essa resolução mais alta nos permite visualizar interações anteriormente ocultas.

Para começar, inicie um terminal Linux para ativar o ambiente Conda. Use o terminal para ativar o ambiente Conda com a ISO net instalada. Crie uma subpasta chamada pasta tomo e depois mova todos os arquivos tomogram para essa pasta.

Em seguida, use o código para gerar um arquivo estrela na pasta do projeto. Usando um editor de texto, abra o arquivo estrela gerado e insira o valor aproximado de desfoco das imagens com inclinação zero grau na quarta coluna. Agora execute o comando de convolução CTFD no terminal.

Após a desconvolução, ative o ambiente da interface gráfica EMAN2 para iniciar o pré-processamento da seleção de partículas. Na seção de tomografia, clique com o botão esquerdo na seta ao lado de dados brutos, selecione importar tomogramas no menu suspenso e escolha os arquivos. Depois, clique com o botão esquerdo na seta ao lado de segmentação e escolha tomogramas pré-processados.

Use parâmetros padrão adequados. Após o pré-processamento, um diretório de informações com arquivos JSON em branco que correspondam aos nomes base dos arquivos de tomografia do processo será criado automaticamente. Adicione informações de pixels angstrom aos arquivos antes de prosseguir.

Para treinar uma rede neural convolucional, ou CNN, a reconhecer a glicoproteína HA, mude o diretório de trabalho para a localização dos tomogramas a serem usados. Depois, abra a interface de treinamento da CNN usando o terminal. Confirme que quatro janelas estão abertas.

Uma contendo as informações sobre parâmetros da CNN e tomogramas no diretório, e as outras três janelas contendo imagens de boas referências, más referências e partículas selecionadas pela CNN. Na interface gráfica da CNN, clique na nova opção para inicializar uma CNN com taxa de aprendizado padrão de 0,0001 e tamanho de caixa de oito. Na coluna nome do arquivo, clique com o botão esquerdo em um tomograma representativo para abri-lo.

Passe o cursor sobre o tomograma aberto e clique na roda do mouse para abrir uma nova janela. Clique com o botão esquerdo no controle do número N para percorrer o eixo Z. Em seguida, no tomograma aberto, use o painel de boas referências para selecionar de 10 a 20 características correspondentes ao HA. Imagens positivas aparecem na janela positiva.

Para remover um, segure shift e clique com o botão esquerdo. Agora mude para o painel de referências ruins e selecione de 10 a 20 referências correspondentes a características como patches de membrana vazios, densidade RNP, marcadores fiduciais e detritos. Defina o número de iterações para 50 e clique no ícone do trem para iniciar o treinamento da CNN.

Após o treinamento concluído, pressione aplicar. Partículas selecionadas serão exibidas no tomograma como círculos azuis ou podem ser vistas na janela de partículas. Continue refinando selecionando referências positivas e negativas adicionais, clicando periodicamente em salvar para preservar o progresso.

Quando a CNN funcionar satisfatoriamente, clique em aplicar tudo para executar a seleção de partículas. Depois, avalie os resultados de vários tomografias e retreine conforme necessário. Para salvar coordenadas para cada tomograma, reabra a interface gráfica do EMAN2 usando o comando e2projectmanager.py.

Clique na seta abaixo da média subtomograma e selecione boxe manual. Agora, insira o nome do tomograma e clique em lançar. Depois, clique sequencialmente em arquivo, salve o cabo da caixa e tomogram_ha.

Envie um texto para salvar as coordenadas. Navegue até a subpasta de rede neural e a subpasta de informações para fazer backup e salvar na rede. HDF, saídas de trem.

HDF, segouts. hdf, e boxes3Dref.hdf. Treine uma segunda CNN para detectar a camada de proteína M1 e a presença do VRNP mudando o tamanho da caixa de treinamento de oito para 14.

Para curar partículas, primeiro baixe os notebooks do repositório do GitHub. Depois, abra o notebook IPYNB de limpeza de partículas CNN e carregue os módulos necessários. Carregue os arquivos de texto das coordenadas HA e M1 no caderno.

Veja-as como nuvens 3D usando a biblioteca 3D aberta. Em seguida, filtre os valores atípicos de coordenadas HA usando o método aberto de remoção estatística 3D de outliers. Em seguida, calcule as distâncias entre as nuvens de pontos HA e M1 identificando pontos HA a mais de 20 pixels de M1 como valores atípicos e salve as coordenadas restantes em um arquivo de texto de saída.

Concatene todas as partículas e salve como arquivos estrela usando o arquivo star pts2. IPYNB. Usando o WarpTools, extraia partículas que dobram o fator quatro e realize a média inicial de subtomogramas em RELION menos quatro usando o código. Converta o arquivo warp star para o formato RELION 4.

Depois, gerar uma referência inicial usando o RELION refine MPI em um subconjunto de partículas. Realize refinamento automático 3D em subtomogramas com o RELION refine MPI. Na convergência, repita o auto refinamento com deslocamento de translação do titã para oito e passo para dois.

Aproveite a classificação 2D para descartar partículas lixo usando o refinamento LION. Crie arquivos estrela com boas classes usando o código, depois combine os arquivos estrela individuais. Tomogramas representativos revelaram virions pleomórficos com formas que variam de esféricas a alongadas.

A média final do subtomograma atingiu uma resolução global de 6,0 angstroms, com resolução local variando de cinco a sete angstroms. Hélices alfa e folhas beta foram resolvidas na reconstrução final do HA, apoiando a qualidade estrutural do mapa refinado. Os sítios de glicosilação foram identificáveis em quatro posições na cabeça e no caule do HA, confirmando a visibilidade da densidade de glicanos na reconstrução final.