Um método minimamente invasivo para gerar um modelo ortotópico singênico de câncer de pulmão em camundongos

Nossa pesquisa atual foca em entender doenças do câncer de pulmão e como desenvolver novas modalidades de tratamento compatíveis com a terapia padrão, incluindo quimioterapia, radioterapia e imunoterapia. Não conseguimos encontrar um modelo ortotópico de câncer de pulmão que estabelecesse critérios específicos para estudar o câncer de pulmão em estágio inicial. Trabalhamos para fornecer diretrizes claras e replicáveis para suprir essa lacuna com esse protocolo.

Esse protocolo é minimamente invasivo e simples de executar. Além disso, com os critérios que fornecemos, esse protocolo permite a triagem de implantação tumoral precisa e possibilita a detecção precoce por meio de imagens bioluminescentes. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem câncer de pulmão em estágio inicial no tecido hospedeiro, possibilitando o avanço pré-clínico de novas terapias contra o câncer e a investigação do microambiente tumoral.

Usaremos essa técnica para avaliar os mecanismos e a eficácia de novos tratamentos empolgantes para o câncer de pulmão de forma pré-clínica e esperamos que isso possa levar ao cuidado futuro dos pacientes. Para começar, coloque o camundongo anestesiado em um cone nasal, na posição deitada em um dispositivo de aquecimento, e aplique pomada oftálmica em ambos os olhos do rato. Uma vez confirmada a anestesia, use uma máquina de cortar elétrica para remover pelos de uma área retangular de dois por três centímetros no lado dorsal esquerdo do rato.

Raspe a partir da coluna medialmente, a mesa lateralmente, a última costela inferior e a borda superior da escápula em direção à cabeça até que não fique visível pelo. Coloque o rato em uma gaiola vazia em um dispositivo de aquecimento. Observe o padrão respiratório até que o camundongo recupere o estado de alerta e então o coloque de volta à gaiola até a cirurgia.

No dia da colheita celular, adicione um substrato fresco contendo 50 miligramas por mililitro de Gentamicina à placa de cultura três a quatro horas antes da coleta. Aspire o meio da placa de cultura e lave as células anexadas com 1x PBS. Em seguida, incube as células com solução de tripsina EDTA por um a dois minutos a 37 graus Celsius.

Adicione um novo substrato para neutralizar a tripsina. Disperse as células batendo suavemente ou pipetando a placa. Depois, colete a suspensão da célula em um tubo cônico de 50 mililitros.

Agora, centrifuge o tubo cônico a 1.200 G por três minutos em temperatura ambiente. Após confirmar a presença de um pellet compacto no fundo, aspire o sobrenadante e lave o pellet com PBS. Ressuspenda o pellet de células lavado em PBS para atingir uma concentração de aproximadamente um a 2 milhões de células por mililitro para contagem.

Filtre a suspensão por um filtro de célula de 40 micrômetros antes de prosseguir. Em seguida, combine 10 microlitros da suspensão celular com 10 microlitros de azul de tripano. Coloque a amostra corada em um hemocitômetro e conte as células.

Calcule o número total de células e a viabilidade das células. Centrifuge as células novamente a 1.200 G por três minutos em temperatura ambiente e aspire o PBS saindo do pellet. Ressuspenda o pellet celular em 0,5 miligramas por mililitro de gel de metra em PBS.

Ajuste para o número desejado de células em um volume total de injeção de 50 microlitros. Mantenha a suspensão da célula no gelo para evitar a solidificação do matrigel. Limpe o local cirúrgico do animal anestesiado três vezes usando gaze estéril, alternando entre Betadine e etanol 70%.

Coloca uma cortina cirúrgica esterilizada com uma abertura de três por quatro centímetros sobre o camundongo e coloca instrumentos cirúrgicos de autoclave sobre a cortina. Usando pinças, identifique a borda craniana da escápula e a borda de proteção da caixa torácica. Com a pele mantida esticada entre o polegar e o indicador do cirurgião, faça uma incisão superficial de cinco milímetros diretamente abaixo da escápula usando uma lâmina de bisturi tamanho 10.

Depois, use uma tesoura reta de 115 milímetros para dissecar a gordura subcutânea das costelas e músculos intercostais sem cortá-los. Para estancar qualquer sangramento leve causado por danos capilares, pressione levemente um aplicador de algodão esterilizado na área do sangramento. Mantenha a incisão aberta usando micro ads e pinças.

Começando na sétima verdadeira costela, use pinças curvas do ponto mediano para contar para cima e localizar a quarta e quinta costelas. Marque essa região como o local da injeção. Agora, inverta suavemente o tubo de suspensão da célula três a quatro vezes para misturar.

Pouco antes da injeção, retire 50 microlitros da suspensão em uma seringa estéril de insulina de oito milímetros de 300 microlitros e 31 bitolas, certificando-se de que não haja bolhas. Coloque uma faixa de quatro milímetros de espessura de fita metálica esterilizada enxaguada à seringa para atuar como tampão e controlar a profundidade da injeção. Injete a suspensão de células de 50 microlitros em um ângulo de 90 graus no espaço intercostal entre as costelas quatro e cinco diretamente abaixo da quarta costela, e mantenha a agulha na posição por dois a três segundos.

Retire a agulha lentamente no mesmo ângulo em que foi inserida e descarte-a em um recipiente para objetos afiados. Por fim, feche a incisão cutânea usando dois a três pontos quadrados com nós e aplique adesivo cirúrgico veterinário sobre os pontos para reforçar o fechamento da ferida. A bioluminescência detectou sinais associados ao tumor nos camundongos experimentais já um dia após a injeção, e a radiância aumentou visivelmente ao longo do tempo tanto para 25.000 quanto para 50.000 células por grupo de camundongos, com maior intensidade observada no grupo de 50.000 células.

O fluxo total de tumores aumentou exponencialmente tanto nos grupos celulares de 25.000 quanto de 50.000, atingindo mais de 10 vezes 10, com a potência de oito fótons por segundo no dia 21 no grupo de 50.000 células. Ratos simulados não apresentaram luminescência nem tumor visível nos pulmões dissecados, enquanto camundongos experimentais apresentaram alta luminescência e massas tumorais vermelhas no tecido pulmonar. Aos 21 dias após a injeção, os camundongos incluídos apresentavam tumores confinados ao lobo pulmonar esquerdo, sem invasão nas regiões ao redor.