Uso da microperfusão cerebral de fluxo aberto para a coleta longitudinal de fluido intersticial em um modelo animal de glioblastoma

Estamos caracterizando componentes de sinalização solúvel dentro do líquido intersticial do tumor cerebral que contribuem para a progressão da doença e resposta ao tratamento. Avaliar as concentrações absolutas de soluto no tumor cerebral intersticial continua sendo um desafio investigativo que exige o uso de métodos experimentais sofisticados. Para começar, com um bisturi estéril, faça uma incisão sagital na linha média ao longo da superfície do crânio, começando entre os olhos e estendendo-se caudal por 8 a 10 milímetros.

Depois, use pinças estéreis para retrair lateralmente a pele da incisão da linha média. Certifique-se de que tanto a bregma quanto a lambda estejam visíveis e estenda a incisão, se necessário. Em seguida, com um bisturi estéril, incisa o periósteo e retrai o tecido lateralmente com pinças.

Aplique peróxido de hidrogênio de 1% a 3% com um aplicador estéril com ponta de algodão para limpar a superfície do crânio. Agora use uma seringa de insulina de 0,3 a 1,0 mililitro para aplicar de 20 a 40 microlitros de adesivo dentário auto-gravante de forma uniforme na superfície do crânio. Depois, exponha-o a uma luz de cura dental para gravar o adesivo.

Depois de curar, remova o excesso de adesivo com aplicadores estéreis com ponta de algodão e soro fisiológico. Reposicione a broca para a coordenada guia cOFM. Ajuste a furadeira para 15.000 rotações por minuto e perfure um furo de rebarba usando o mostrador do micromanipulador DV.

Monitore frequentemente a espessura do crânio durante a perfuração e lave com soro fisiológico para remover detritos e reduzir o calor. Repita o procedimento de perfuração em cada coordenada do parafuso de ancoragem. Agora instale parafusos de ancoragem usando pinças estéreis e uma chave de fenda estéril até inserir um ou dois comprimentos de rosca de profundidade.

Depois, monte o guia cOFM e o conjunto do dummy no suporte do guia e prenda o suporte ao quadro estereotáxico. Posicione a ponta guia acima do furo da rebarba e abaixe-a lentamente até a profundidade predeterminada a 1 milímetro por minuto. Aplique o agente cimentante no crânio em camadas finas e uniformes, cobrindo áreas sob e ao redor da guia e parafusos do cOFM.

Use uma luz de cura dental para endurecer cada camada antes de aplicar a próxima. Certifique-se de que o cimento cubra toda a área entre os componentes, evitando a cunha de travamento. Desconecte o suporte do guia do guia cOFM e levante-o lentamente usando o botão DV do micromanipulador.

Usando pinças, remova a cunha de travamento do guia cOFM e do conjunto do dummy. Levante o boneco do guia com cuidado. Use os botões dos micromanipuladores ML e AP para alinhar o conjunto do insert de infusão da seringa sobre o guia cOFM.

Abaixe o inserto de infusão usando o botão DV e fixe-o na posição reinserindo firmemente a cunha de travamento com pinças. Agora injete 3 microlitros de suspensão celular da seringa a 1 microlitro por minuto. Monitore a área ao redor do guia cOFM para garantir que nenhum efluxo de suspensão de células saia do conjunto.

Use pinças para remover a cunha de travamento do guia e do conjunto do insert de infusão. Depois, levante cuidadosamente o inserto de infusão do guia usando o botão de ajuste DV. Preencha as linhas de tubo de empurrar e puxar com líquido cefalorraquidiano artificial usando seringas de vidro herméticas.

Instale a seção peristáltica do tubo na cabeça da bomba de microperfusão. Conecte o saco de perfusidade ao tubo de empurrar usando um conector Luer lock. Depois, conecte o inserto de amostragem ao tubo usando conectores flangeados.

Conecte o eixo de entrada mais longo à extremidade de saída do tubo de empurrar e o eixo de saída mais curto à extremidade de entrada do tubo de tração. Coloque o inserto de amostragem conectado em um tubo estéril de microcentrífuga contendo 750 micrólitros de líquido cefalorraquidiano artificial. Conecte a agulha do coletor de frações à linha de saída do tubo de tração usando um conector de tubo flangeado.

Depois, faça uma lavagem de tubo por 20 minutos a 10 microlitros por minuto para eliminar bolhas de ar. Em seguida, preencha a linha do tubo de puxar com líquido cefalorraquidiano artificial usando seringas à prova de gás. Reinstale o tubo peristáltico na cabeça da bomba de microperfusão.

Conecte novamente o inserto de amostragem usando conectores de tubo flangeado. Conecte a entrada na extremidade de saída do tubo de puxação e a saída na extremidade de entrada do tubo de puxação. Coloque o insert em um tubo estéril de microcentrífuga com 750 microlitros de líquido cefalorraquidiano artificial.

Faça outra lavagem de 20 minutos do sistema de tubos a 10 microlitros por minuto para eliminar quaisquer bolhas residuais de ar. Coloque um animal anestesiado em uma jaqueta do tamanho apropriado. Passe completamente os membros anteriores pelas cavas e prenda a jaqueta firmemente nas costas do animal.

Use uma pinça para remover a cunha de travamento do guia e do conjunto do dummy. Depois, levante cuidadosamente o inserto do dummy do guia. Instale delicadamente o inserto de amostragem no guia e reinsira a cunha de travamento.

Retire o animal da anestesia e coloque-o no sistema de gaiola giratória. Prenda o laço da gaiola ao casaco do animal e ative o sistema de gaiola giratória. Após a amostragem cOFM, desative o sistema de gaiola rotativa e desconecte o laço da gaiola da jaqueta animal.

Agora use pinças para remover a cunha de travamento do conjunto guia e inserto de amostragem. Levante cuidadosamente o inserto de amostragem do guia, depois insira suavemente o inserto de dummy de volta no guia e reinsira a cunha de travamento. Dê os fechos das costas da jaqueta do animal e remova-a suavemente do animal.

Imagens bioluminescentes confirmaram a presença de tumores em animais com transplante celular mediado por guia cOFM. A análise proteômica de componentes principais do fluido intersticial amostrado por cOFM revelou uma separação distinta entre grupos animais tratados com temozolomida e tratados com dimetil sulfóxido. As distribuições globais de sinais metabolômicos se sobrepuseram quase perfeitamente entre amostras de temozolomida e dimetil sulfóxido.

Apesar da sobreposição de sinais, a análise metabolômica de vulcões revelou uma mudança distinta impulsionada pelo temozolomida. Comparações quantitativas dos valores metabolômicos dos mesmos animais mostraram que configurações recirculadas melhoraram as concentrações de analitos enquanto preservavam proporções relativas de metabólitos. A disponibilidade relativa de nutrientes no microambiente tumoral cerebral ainda é pouco compreendida.

Esse protocolo está sendo usado para preencher essa lacuna. Caracterizar a disponibilidade e sinalização de nutrientes no microambiente tumoral pode elucidar os mecanismos da progressão do glioma e da resistência adaptativa ao tratamento.