Produção e uso de moldes de agarose personalizáveis para cultura de folículos ovarianos de camundongos sem andaimes

Nossa pesquisa visa desenvolver métodos personalizáveis, fisiomiméticos e sem andaimes para cultivar folículos para determinar se podem melhorar a qualidade dos folículos cultivados in vitro e dos óócitos que eles desenvolvem. Atualmente, o método de cultura mais avançado utiliza um sistema de crescimento folicular in vitro encapsulado em hidrogel, que permite que os folículos mantenham sua arquitetura tridimensional durante a foliculogênese. A encapsulação de hidrogênio é tecnicamente desafiadora, trabalhosa, de baixo rendimento e, infelizmente, não é compatível com métodos automáticos de imagem.

Além disso, o encapsulamento 3D oferece suporte uniforme, que não imita a fisiologia in vivo. Criamos moldes biocompatíveis impressos em 3D que suportam as células altamente sensíveis dos oócitos. Folículos cultivados em ambiente sem andaimes apresentaram crescimento e ovulação melhorados, sem comprometer a produção de hormônios em comparação com técnicas estabelecidas.

Estamos abordando a necessidade de um sistema de cultura fácil de usar e personalizável que possa imitar melhor o ambiente natural dos folículos. A imagem em time-lapse também permite acompanhamento e análise ao vivo do desempenho do folículo. Para começar, inicie o software CAD em um sistema de computador.

Abra o arquivo de etapas de design da base do molde mestre de 24 poços no software. Selecione a área interna da superfície do objeto. Depois, navegue até a aba Sólido no espaço de trabalho de design e selecione Criar Esboço para inserir o design desejado do micromolde.

Agora, introduza as dimensões x e y desejadas e o número dos micropoços. Depois, selecione Finalizar Esboço na barra de ferramentas. Crie os micropoços de 800 micrômetros de profundidade usando a função Extrudir selecionando sequencialmente Sólido, Criar e Extrudir.

Agora, escolha um filete de raio de 0,1 milímetro para o topo dos micropoços clicando em Design, Sólido, Modificar e Filet. Adicione um filé de raio de 0,25 milímetro para criar um micropoço de fundo arredondado. Salve o novo design do molde mestre e exporte uma cópia em formato de passo selecionando Arquivo e pressionando Exportar.

Abra o recipiente de silicone fundido com 24 poços em um passo. Depois, insira o novo design do molde mestre como um componente externo, clicando com o botão direito no arquivo salvo e selecionando Inserir no Design Atual. Em seguida, clique com o botão direito no componente inserido e selecione Quebrar Link para remover a referência ao design do molde mestre.

Centralize o novo design do molde mestre dentro da superfície do recipiente de silicone fundido com 24 poços, garantindo que ele fique voltado para dentro. Selecione OK para alinhar os objetos. Selecione a operação de Corte, usando o recipiente como corpo alvo e o molde mestre como corpo da ferramenta para criar a cavidade de moldagem de silicone.

Salve e exporte o novo molde de silicone de 24 poços como arquivos stl e step. Abra os arquivos STL do novo molde de silicone de 24 poços um e do recipiente de silicone fundido de 24 poços dois usando um software de preparação para impressão 3D. Oriente a impressão com micropilares voltados para cima e use a função Furar para criar uma abertura de um milímetro de largura ao lado da impressão.

Imprima ambos os designs de recipientes com uma espessura de camada de 25 micrômetros. Lave as impressões finalizadas conforme as instruções do fabricante. Depois, borrife extensivamente a seção do micropilar com isopropranal 95%.

Remova qualquer etanol restante com ar comprimido. Após secar e curar, inspecione cada impressão usando um microscópio estereoscópico. Certifique-se cuidadosamente de que todos os micropilares estejam separados e uniformes em tamanho e aparência.

Após a cura, cubra a parte externa da impressão com Parafilm se o canal de perfuração não estiver preenchido, e armazene até novo uso. Em seguida, coloque o silicone preparado em um dessecador a vácuo por cinco minutos para remover as bolhas de ar. Despeje a mistura de silicone com fluxo uniforme no molde impresso em 3D, garantindo que o nível coincida ou fique um pouco abaixo da superfície do molde para garantir a planura.

Remova o ar preso com uma ponta de pipeta P200 e desgase novamente se necessário. Cure o silicone em temperatura ambiente em um dessecador por pelo menos cinco horas ou, de preferência, durante a noite. Após a cura, remova o silicone do molde e inspecione os micromoldes sob um microscópio estereoscópico.

Remova qualquer material excedente do canal de perfuração e descarte moldes com pontes ou poços danificados. Em seguida, coloque o molde de silicone no recipiente dois do molde de silicone para a segunda etapa da moldagem, garantindo que a abertura lateral esteja alinhada. Borrife levemente o molde de silicone com óleo mineral seguro para embriões.

Remova o excesso de óleo dos micropoços usando ar comprimido. Repita o procedimento de mistura de silicone e despeje a nova mistura no segundo recipiente, mantendo o nível na superfície ou abaixo da superfície do molde. No dia seguinte, separe o silicone do molde impresso em 3D e os moldes de silicone um e dois um do outro.

Após inspecioná-los microscópicamente, descarte os moldes com micropilares comprometidos ou excesso de óleo nos poços. Agora, lave o molde de silicone com 70% de etanol. Deixe secar ao ar por 30 minutos dentro de um exaustor de fluxo laminar.

Quando seco, coloque o molde em uma bolsa de esterilização antes de autoclavar. Dobre levemente a ponta do stripper para aumentar a precisão durante a transferência do folículo. Transfira os folículos rapidamente para evitar flutuações de pH ou temperatura.

Ao microscópio, use uma ponta decapadora de 200 micrômetros para transferir 10 folículos secundários multicamadas por micromolde, colocando-os em micropoços adjacentes. Confirme que todos os 10 folículos têm tamanho semelhante antes de finalizar a configuração. Em seguida, coloque uma tampa de focalizador de luz em um microscópio portátil.

Insira o microscópio com suporte em uma incubadora e conecte-se a um laptop com o software. Posicione e alinhe bem a cultura sob o microscópio e ajuste altura e foco para que todos os folículos fiquem visíveis. Use balanço de branco automático, AWB e controle de LED.

Desligue a exposição automática, AE e selecione o tempo de exposição ideal. Inicie a imagem em time-lapse com duração de oito dias e intervalo de 30 minutos. Selecione a foto e desligue o LED quando não estiver capturando imagens.

Folículos cultivados em micromoldes de agarose apresentaram crescimento contínuo e formação de cavidades antrais. Após a indução da ovulação, os folículos cultivados em micromoldes de agarose produziram mais óvulos ovulados em comparação com os do alginato. Demonstrando ainda mais a biocompatibilidade, a morfologia do fuso dos ovos M2 não diferia significativamente entre os grupos.

Os folículos encapsulados em alginato não mantiveram sua posição durante a cultura e são incompatíveis com imagens em time-lapse. Durante a imagem em time-lapse, a morfologia individual dos folículos, incluindo o diâmetro, circularidade e razão de aspecto de Feret, pôde ser acompanhada e medida instantaneamente ao longo do período de cultura. A tomografia de coerência óptica permitiu visualização 3D das estruturas internas dos folículos e também capturou eventos dinâmicos de ruptura folicular durante a ovulação.

Micromoldes de agarose permitiram a análise histológica de múltiplos folículos no mesmo plano após a incorporação e secção da parafina, possibilitando a identificação ou ausência de tecido e o suporte à coloração H&E. Para demonstrar a personalização desse método, foi criada uma versão de alto rendimento e 96 poços, com 10 micropoços por molde, e foi fabricada com sucesso. Assim como no design de 24 poços, era compatível com imagens em time-lapse de folículos.