Name: Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a avaliar toxicidade no desenvolvimento usando células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Este ensaio monitora em tempo real a interrupção da sinalização FGF/SRF, oferecendo uma alternativa precisa aos testes em animais.

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<ol><li>Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+causes+of+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Teratogenic causes of malformations.</a> Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).</li>
<li>DeSesso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+developmental+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Future of developmental toxicity testing.</a> Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).</li>
<li>Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+developmental+toxicity+in+rats+and+rabbits%3A+Generation+of+a+reference+compound+list+for+development+of+alternative+testing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches.</a> Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).</li>
<li>Vargesson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide-induced+teratogenesis%3A+History+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).</li>
<li>van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+strategies+for+embryo-fetal+toxicity+of+human+pharmaceuticals.+Animal+models+vs.+in+vitro+approaches%3A+A+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).</li>
<li>Kanno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+assay+system+to+monitor+fibroblast+growth+factor+signal+disruption+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).</li>
<li>Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fibroblast+growth+factor+signal+disruptions+in+human+iPS+cells+for+prediction+of+teratogenic+toxicity+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals.</a> J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).</li>
<li>Kanno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+developmental+toxicity+assay+based+on+human+iPSC+reporter+to+detect+FGF+signal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption.</a> iScience. 25 (2), 103770(2022).</li>
<li>Miano, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+response+factor+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Role of serum response factor in the pathogenesis of disease.</a> Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).</li>
<li>Purvis, J. E., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+decoding+cellular+information+through+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics.</a> Cell. 152 (5), 945-956 (2013).</li>
<li>Paradis, F. -H., Hales, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+valproic+acid+inhibits+chondrogenesis+and+osteogenesis+in+mid-organogenesis+mouse+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs.</a> Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).</li>
<li>Bosman, S. L., Sonnen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+oscillations+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling oscillations in embryonic development.</a> Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>DeKelver, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics%2C+proteomics%2C+and+regulatory+DNA+analysis+in+isogenic+settings+using+zinc+finger+nuclease-driven+transgenesis+into+a+safe+harbor+locus+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome.</a> Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).</li>
<li>Hales, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+mutagenicity+and+teratogenicity+of+cyclophosphamide+and+its+active+metabolites%2C+4-hydroxycyclophosphamide%2C+phosphoramide++mustard%2C+and+acrolein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein.</a> Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).</li>
<li>Genschow, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests%3A+Results+of+the+definitive+phase+and+evaluation+of+prediction+models%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models.</a> Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).</li>
<li>Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+novel+high-throughput+embryonic+stem+cell+tests+with+new+molecular+markers+for+screening+embryotoxic+chemicals+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro.</a> Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).</li>
<li>Uibel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReProGlo%3A+A+new+stem+cell-based+reporter+assay+aimed+to+predict+embryotoxic+potential+of+drugs+and+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals.</a> Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).</li>
<li>Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Signaling+pathways+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Editorial: Signaling pathways in embryonic development.</a> Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>FastGene</td><td>FG-MCT015C</td><td>Preparação de produtos químicos de teste</td></tr><tr><td>Tubo centrífugo de 15mL</td><td>VIOLAMO</td><td>1-3500-21</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Tubo PCR de 8 tiras</td><td>Watson</td><td>137-333C</td><td>Preparação de produtos químicos de teste</td></tr><tr><td>Placa inferior branca/transparente de 96 poços, superfície TC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165306</td><td>Medições de cultura celular e luminescência</td></tr><tr><td>Microplaca preta Fundo Plano, 96Well</td><td>ASONE</td><td>3-3321-04</td><td>Para medição de luminescência em ensaios de citotoxicidade</td></tr><tr><td>Respire MAIS FÁCIL</td><td>TOHO</td><td>BERM-2000</td><td>Filme de vedação permeável ao gás</td></tr><tr><td>Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Ensaio de citotoxicidade</td></tr><tr><td>Centrífuga 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifugação</td></tr><tr><td>ClipTip 300, Filtrado, Estéril, Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420513</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 50, Filtrado, Estéril, Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420253</td><td></td></tr><tr><td>Condessa 3 FL Contador Automático de Células</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Slides da Câmara de Contagem de Células da Condessa</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Cultura Claro DMSO&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>031-24051</td><td>Solvente para produtos químicos</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>036-24023</td><td>Inibidor de ROCK para semeadura de iPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 HEPES, sem fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>Revestimento para cultura celular iPS</td></tr><tr><td>F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 a 300 & micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 5 a 50 & micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4661160N</td><td></td></tr><tr><td>Chip de filtro</td><td>Watson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Geltrex Reduzida de Fator de Crescimento Reduzido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Revestimento para cultura celular iPS</td></tr><tr><td>HIENAI Mat 01R</td><td>COSMO BIO</td><td>HMAT01R</td><td>Para manter a estabilidade da temperatura da placa durante o manuseio em cultura celular</td></tr><tr><td>Aquecedor de Tubo HIENAI GX01</td><td>COSMO BIO</td><td>TWGX013</td><td>Para manter o meio quente durante manuseio experimental</td></tr><tr><td>Proteína recombinante bFGF estável ao calor humano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0367</td><td>Estimulação FGF para ensaio repórter</td></tr><tr><td>Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas (iPS)</td><td>201B7 (Cat³ RCB HPS0063, RRID: CVCL_A324)</td><td>Banco de Células RIKEN BRC</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>TAITEC</td><td>0089532-000</td><td>Tremor de placa para teste de citocitocicidade</td></tr><tr><td>Leitor multiplate</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO X4</td><td>Medição de luminescência</td></tr><tr><td>Substrato de Célula Viva de Endurazina Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N2571</td><td>Substrato de luminescência</td></tr><tr><td>PBS (-)&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>166-23555</td><td>Culutre celular</td></tr><tr><td>Parafilim</td><td>COMO UM</td><td>65-1681-93</td><td>Armazenado para revestimento de placa</td></tr><tr><td>Pipetto</td><td></td><td>eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>WSL-1563 KronosHT</td><td>ATTO</td><td>3510140</td><td>Sistema de medição de luminescência em tempo real &nbsp;</td></tr><tr><td>Reservatório</td><td>BMBio</td><td>BM-0850-1</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif APEL2 Médio &nbsp;</td><td>Tecnologias STEMCELL</td><td>ST-05275</td><td>Meio de ensaio</td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td><td>Meio de manutenção</td></tr><tr><td>Água Estéril, Livre de Endotoxinas</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-15645</td><td>Controle de umidade para cultura celular iPS</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos VTC-P6</td><td>VIOLAMO</td><td>2-8588-01</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>TrypL Select Enzima (1X), sem fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Ácido valproico</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>227-01071</td><td>Produto químico de teste</td></tr></tbody></table>

ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Developmental Toxicity Assay Based on Real-Time Monitoring of Fibroblast Growth Factor Signal Disruption in Human Induced Pluripotent Stem Cells

Em nossa experiência, a morfologia celular é útil para determinar se um ensaio foi realizado corretamente. A Figura 2A mostra imagens típicas de microscopia confocal de células imediatamente antes e depois da exposição química. No final do ensaio, quase toda a superfície dos poços é coberta por células. A Figura 2B mostra imagens de coloração de células vivas/mortas. O número de células mortas coradas com iodeto de propídio (PI) aumenta após a exposição química; no entanto, a viabilidade celular é de pelo menos 50%, e quase todas as células são coradas com calceína-AM.
O quadro 1 enumera os produtos químicos utilizados nos nossos estudos anteriores 7,8. Esses estudos demonstram que os produtos químicos Devtox podem ser distinguidos com maior precisão com base na interrupção do sinal FGF em células iPS humanas. Uma descoberta importante é que o monitoramento contínuo da atividade de sinalização é fundamental porque muda dinamicamente ao longo do tempo. O uso de um sistema de medição de luminescência em tempo real fornece resolução de tempo consideravelmente maior com menos trabalho de medição. Aqui, descrevemos um protocolo que usa um sistema de monitoramento em tempo real.
A figura 3A mostra as alterações na intensidade de luminescência ao longo de 48 h em seis poços replicados nas mesmas condições sem o produto químico em estudo. As seis curvas estão quase alinhadas, indicando boa reprodutibilidade poço a poço. Embora não sejam claramente identificados em medições manuais de 24 horas em nossos estudos anteriores, dois picos distintos - um pico inicial imediatamente após a adição do ligante FGF e um segundo pico em aproximadamente 24 horas - aparecem em medições em tempo real de 48 horas. A Figura 3B mostra mudanças na intensidade da luminescência após a exposição ao ácido valpróico (VPA), um tóxico de desenvolvimento bem conhecido. O VPA é um inibidor da histona desacetilase que causa defeitos no tubo neural, coração e membros¹¹. O VPA interrompe a sinalização do FGF de maneira dependente da concentração. O sistema automatizado de medição em tempo real capturou a dinâmica do sinal com mais precisão do que as medições manuais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Ensaio de interrupção de sinal FGF/SRF. (A) Engenharia genética de células iPS humanas para gerar células repórter de sinal FGF / SRF. Um plasmídeo foi construído contendo Nluc a jusante do elemento de resposta sérica, braços homólogos para knock-in direcionado e o gene de resistência à puromicina sob o controle do promotor da fosfoglicerato quinase humana. Após a seleção de puromicina, células repórter SRE-Nluc foram estabelecidas. (B) Cronograma do ensaio. As células repórter foram semeadas em uma placa de 96 poços e cultivadas por 4 dias para cobrir toda a superfície. O substrato luminescente e o produto químico em estudo foram adicionados 3 e 1 h antes do início da medição, respetivamente. O tempo de adição do ligante FGF foi definido como 0 h e a intensidade de luminescência foi medida continuamente nas 48 h seguintes. (C) Análise de dados. A dinâmica do sinal foi registrada em células expostas e não expostas a produtos químicos em teste e normalizadas para o controle do veículo para estimar a área entre as curvas como o grau de interrupção do sinal causada por um produto químico. Os valores de ABC foram obtidos para cada produto químico em diferentes concentrações e sua soma foi calculada. A análise da curva característica de operação do receptor foi realizada usando todos os tóxicos de desenvolvimento conhecidos testados para determinar o limiar. Abreviaturas: iPS = células-tronco pluripotentes induzidas; RLU = Unidade de Luz Relativa; AUC = Área sob a curva; FGF = fator de crescimento de fibroblastos; SRF = fator de resposta sérica; SRE = elemento de resposta sérica; HA = braço homólogo; L = esquerda; R = direita; PuroR = gene de resistência à puromicina; hPGK = fosfoglicerato quinase humano; Nluc = NanoLuc luciferase; ROC = característica de funcionamento do receptor; ABC = área entre as curvas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig2.jpg"> 
Figura 2: Morfologia celular e coloração de células vivas / mortas. A) Imagens microscópicas confocais das células antes (dia 4) e depois (dia 6) da exposição a um produto químico em estudo. As células restantes cobrindo quase toda a superfície dos poços após o teste são um indicador de um teste bem-sucedido. A cobertura quase completa do poço no final do ensaio indica uma execução bem-sucedida. B) Coloração de células vivas/mortas antes e depois da exposição a um produto químico em estudo. As células vivas foram coradas de verde com Calceína-AM, e as células mortas foram coradas de vermelho com iodeto de propídio (PI). foram corados com calceína-AM (verde) e células mortas com iodeto de propídio (PI, vermelho). A proporção de células mortas deve ser menor do que deveria ser &lt; 50% do total de células. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig3.jpg"> 
Figura 3: Exemplos típicos de dinâmica de intensidade de luminescência. (A) A luminescência do curso do tempo altera o curso do tempo da luminescência após a estimulação do ligante FGF, medido usando um sistema de medição de luminescência em tempo real. A intensidade da luminescência foi monitorada a cada 22 min por 48 h. As seis linhas coloridas representam sinais de diferentes poços. (B) Comparação de medições de luminescência manuais e em tempo real com ácido valpróico. A interrupção do sinal foi observada com ambos os métodos de medição, enquanto o monitoramento em tempo real capturou mais claramente o sinal aprimorado no segundo pico. Abreviaturas: RLU = Unidade de Luz Relativa; VPA = ácido valpróico; FGF = fator de crescimento de fibroblastos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Produto químico em estudo</td>
			<td>Abreviação</td>
			<td>Cas NÃO.</td>
			<td>Estudo em animais (estudo anterior)</td>
			<td>Estudo in vitro (este estudo)</td>
			<td>Soma dos valores ABC</td>
			<td>Concentração Máxima (μg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ácido totalmente trans-retinóico</td>
			<td>ATRA</td>
			<td>302-79-4</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>65.9</td>
			<td>0.0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hidroxiuréia</td>
			<td>HU</td>
			<td>127-07-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>63.3</td>
			<td>149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido metoxiacético</td>
			<td>MAA</td>
			<td>625-45-6</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>225</td>
			<td>683</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloreto de metilmercúrio</td>
			<td>MeHg</td>
			<td>115-09-3</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>77.7</td>
			<td>1.20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hidrato de metotrexato</td>
			<td>MTX</td>
			<td>133073-73-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>80.5</td>
			<td>5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salicilato de sódio</td>
			<td>SA</td>
			<td>54-21-7</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>38.7</td>
			<td>666</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ácido valpróico</td>
			<td>VPA</td>
			<td>99-66-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>63.3</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminonicotinamida</td>
			<td>6-AN</td>
			<td>329-89-5</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>24.9</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido bórico</td>
			<td>BA</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>24.2</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2'-desoxiuridina</td>
			<td>BrdU</td>
			<td>59-14-3</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>83.9</td>
			<td>50.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5-Dimetil-2,4-oxazolidinediona</td>
			<td>DMO</td>
			<td>695-53-4</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>50.3</td>
			<td>840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloreto de lítio</td>
			<td>LiCl</td>
			<td>7447-41-8</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>29.8</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>5-FU</td>
			<td>51-21-8</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>92.4</td>
			<td>2.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciclofosfamida monohidratada</td>
			<td>CPA</td>
			<td>6055-19-2</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>19.1</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesilato de imatinibe</td>
			<td>IMA</td>
			<td>220127-57-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>42.4</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenalidomida</td>
			<td>LEN</td>
			<td>191732-72-6</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>94.7</td>
			<td>35.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomida</td>
			<td>POM</td>
			<td>19171-19-8</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>50.9</td>
			<td>2.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talidomida</td>
			<td>THA</td>
			<td>50-35-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>53.3</td>
			<td>12.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrilamida</td>
			<td>AcA</td>
			<td>79-06-01</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>37.1</td>
			<td>454</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Cânfora</td>
			<td>CAME</td>
			<td>464-49-3</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>27.5</td>
			<td>50.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridrato de difenidramina</td>
			<td>DHM</td>
			<td>147-24-0</td>
			<td>N</td>
			<td>P</td>
			<td>68.2</td>
			<td>262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ftalato de dimetilo</td>
			<td>DMP</td>
			<td>131-11-3</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>24.4</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilina G sal de sódio</td>
			<td>Peng</td>
			<td>69-57-8</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>22.1</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarina sódica</td>
			<td>SAC</td>
			<td>82385-42-0</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>34.0</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paracetamol</td>
			<td>APAP</td>
			<td>103-90-2</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>22.3</td>
			<td>20.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trihidrato de amoxicilina</td>
			<td>AMX</td>
			<td>61336-70-7</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>28.4</td>
			<td>25.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimetidina</td>
			<td>CENTÍMETRO</td>
			<td>51481-61-9</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>25.3</td>
			<td>30.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eritromicina</td>
			<td>ERY</td>
			<td>114-07-8</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>20.0</td>
			<td>15.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hidroclorotiazida</td>
			<td>HCTZ</td>
			<td>58-93-5</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>21.9</td>
			<td>20.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfassalazina</td>
			<td>SSZ</td>
			<td>599-79-1</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>30.8</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Químico</td>
			<td>AUC</td>
			<td>Limiar</td>
			<td>Sensibilidade</td>
			<td>Especificidade</td>
			<td>Exatidão</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 substâncias</td>
			<td>0.819</td>
			<td>37.9</td>
			<td>0.778</td>
			<td>0.917</td>
			<td>0.833</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Produtos químicos Devtox e não Devtox classificados em experimentos com animais e resultados estimados com e sem interrupção do sinal de FGF. Abreviaturas: P = positivo (Devtox); N = negativo (não Devtox).

Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Developmental toxicity (Devtox) is typically evaluated in animal models. However, there are challenges in ensuring accuracy, such as false negatives due ...

developmental-toxicity-assay-based-on-real-time-monitoring-fibroblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós demonstramos o protocolo para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas humanas usando lentivírus mediada entrega dos fatores humanos Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Pluripotência foi confirmado pela morfologia e pela presença de tronco embrionárias (ES) de células específicas marcadores.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Os protocolos descrevem dois sistemas in vitro de testes de toxicidade de desenvolvimento (UKK e UKN1) com base em células estaminais embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Os sistemas de teste prever risco de toxicidade para o desenvolvimento humano, e pode contribuir para reduzir os estudos em animais, dos custos e do tempo necessário para os testes de segurança química.

Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

Aprenda a avaliar toxicidade no desenvolvimento usando células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Este ensaio monitora em tempo real a interrupção da sinalização FGF/SRF, oferecendo uma alternativa precisa aos testes em animais.

Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

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