Chip microfluídico para construção de modelos de lesão axonal e habilitação de análise multiômica

Desenvolvemos chips microfluídicos em larga escala para permitir a análise multiômica, com o objetivo de ilustrar o mecanismo metabólico dos neurônios após a lesão axonal. Utilizamos principalmente a tecnologia microfluídica, a análise do fluxo metabólico e a transcriptômica para avançar na pesquisa sobre os mecanismos metabólicos dos neurônios durante a lesão axonal e a regeneração. Descobrimos que existem diferenças metabólicas entre os neurônios corticais em diferentes doenças do desenvolvimento e que os neurônios jovens sofrem remodelação metabólica após lesão externa.

A principal vantagem do nosso protocolo está no design da plataforma microfluídica em larga escala e nos padrões operacionais, que permitem multiômica precisa e tamanho de milhões de células. Para começar, transfira a base PDMS e o agente de cura para um tubo de centrífuga. Coloque o tubo de centrifugação contendo a mistura em um misturador centrífugo.

Centrifugar duas vezes a 2 000 g durante quatro minutos para misturar e desgaseificar. Despeje 13 a 15 gramas do PDMS desgaseificado no molde microfluídico, garantindo que o fundo do molde esteja completamente coberto. Agora, coloque o molde em um dessecador a vácuo e, em seguida, use uma bomba de vácuo para evacuar o ar por cinco a 10 minutos para remover completamente as bolhas do PDMS.

Usando um bulbo de borracha, bata suavemente na superfície do PDMS para quebrar as bolhas de superfície restantes. Transfira o molde para um forno de convecção e leve ao forno a 80 graus Celsius por 100 minutos para curar o polidimetilsiloxano. Quando o PDMS estiver totalmente curado, deslize suavemente a ponta de um bisturi sob a borda do PDMS para levantá-lo e separá-lo cuidadosamente do molde.

Usando um punção de biópsia com um diâmetro de 2,0 a 2,5 milímetros, crie orifícios no PDMS para infusão de meio de cultura e carregamento celular. Remova quaisquer impurezas da superfície do PDMS usando fita adesiva, coloque-o em um prato de vidro limpo e embrulhe-o com papel alumínio para armazenamento. Antes do experimento, autoclave o dispositivo microfluídico a 121 graus Celsius e 101 quilopascais por cinco minutos para garantir a esterilidade.

Coloque uma lamínula destinada a dispositivos microfluídicos convencionais em uma placa de cultura de 35 milímetros. Adicione dois mililitros de 0,1 miligrama por mililitro de solução de poli-D-lisina ao prato. Incube o prato a 37 graus Celsius por seis horas ou durante a noite.

Após a incubação, recupere cuidadosamente a solução de poli-D-lisina para reutilização ou descarte adequado. Agora, adicione dois mililitros de água ultrapura estéril ao prato. Gire-o 50 vezes no sentido horário, seguido de 50 vezes no sentido anti-horário.

Aspire a água usando uma bomba de vácuo conectada a uma ponteira de pipeta estéril, coletando os resíduos em um recipiente de resíduos líquidos. Depois que todas as lavagens estiverem concluídas, deixe as lamínulas secarem naturalmente em um armário de biossegurança antes de usar. Usando uma pinça de ponta fina estéril, coloque o chip microfluídico autoclavado no centro da superfície do vidro com os microcanais voltados para baixo.

Pressione suavemente o chip na superfície do vidro usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros para garantir a adesão completa. Em seguida, marque a câmara esquerda com um ponto usando um marcador permanente para designar o compartimento do soma. Aspire 10 microlitros de suspensão neuronal com uma pipeta de 10 microlitros e, em seguida, dispense lentamente a suspensão na porta de carregamento acima do compartimento de soma marcado.

Confirme o fluxo de fluido adequado no reservatório inferior da câmara esquerda. Transfira a placa de cultura para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 20 minutos. Após a incubação, coloque a placa sob um microscópio 20X para confirmar a profusão do meio do compartimento do soma para o compartimento axonal através dos microcanais.

Agora, pipete 150 microlitros de meio basal neuronal para a porta superior do compartimento axonal. Da mesma forma, adicione 150 microlitros de meio neuronal completo à porta superior do compartimento do soma. Em seguida, despeje 20 mililitros de água ultrapura em uma placa de cultura de 150 milímetros para criar uma câmara de umidade.

Coloque a placa de cultura de 35 milímetros dentro da placa grande, transfira todo o sistema de cultura para a incubadora e mantenha pelo tempo necessário. Use uma placa de Petri de 10 centímetros de largura para a colocação do dispositivo microfluídico em grande escala. Escolha a semeadura de canal completo ou de canal intervalado com base nas necessidades experimentais, pois cada método requer diferentes protocolos de lesão axonal.

Após a semeadura, adicione cinco mililitros de meio de cultura de neurônios completo à placa de Petri para manter o crescimento dos neurônios. Transfira uma quantidade apropriada de meio basal neuronal para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros para uso posterior. Coloque um dispositivo microfluídico contendo neurônios corticais em uma bancada limpa.

Usando papel sem fiapos, seque o fundo da placa de cultura de 35 milímetros e, em seguida, use uma pipeta de 200 microlitros para aspirar o meio dos dois orifícios do lado direito do dispositivo microfluídico. Em seguida, conecte uma tubulação de bomba de vácuo a uma ponta de pipeta estéril e sem filtro de 200 microlitros. Ligue a bomba de vácuo a uma taxa de sucção de 60 litros por minuto e aponte a ponta para o ponto de conexão entre o orifício inferior da câmara terminal do axônio e a câmara para aspirar o meio antigo, causando quebra do axônio devido à pressão negativa.

Recoloque a ponta da pipeta e retire 150 microlitros de meio neuronal basal, adicionando-o lentamente pelo orifício inferior da câmara direita. Após a adição e aspiração quatro vezes, substitua por meio neuronal completo fresco, aspire o meio antigo do orifício lateral do corpo celular e adicione meio neuronal completo novo contendo drogas, se necessário. Coloque o dispositivo microfluídico junto com a placa de cultura em uma placa de cultura de 150 milímetros e continue a cultura pelo tempo necessário, como 24 horas.

Para lesão axonal manual, semeie neurônios em todas as câmaras do dispositivo microfluídico de grande escala. Incube o dispositivo a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por três dias. No sétimo dia in vitro, remova a placa de cultura contendo o dispositivo microfluídico da incubadora e coloque-a em um estágio estéril.

Prepare um microscópio com ampliação de 20X e esterilize a área de trabalho usando etanol 75%. Segure uma ponta de pipeta filtrada estéril de 10 microlitros e identifique feixes de axônios nos microcanais originais sob orientação microscópica. Faça arranhões longitudinais ao longo de cada feixe de axônios usando a ponta da pipeta.

Observe a quebra do axônio sob o microscópio em tempo real. Os microcanais de um dispositivo microfluídico padrão permitem o crescimento de axônios, mas não de soma, conforme confirmado pela coloração com beta-três tubulina em sete dias in vitro. A densidade neuronal não mostrou diferença significativa após a lesão axonal, indicando nenhuma morte neuronal observável.

Um dispositivo microfluídico de grande escala com um design tridimensional expansível foi desenvolvido para análises multiômicas. As réplicas PDMS não perfuradas e perfuradas aderiram com segurança a pratos de 10 centímetros ou placas de PC. O dano axonal induzido pelo arranhão da ponta da pipeta levou a axônios claramente cortados com morfologia interrompida, em contraste com axônios intactos antes da lesão.

A regeneração axonal foi observada seis horas e 24 horas após a lesão, enquanto os axônios não lesionados permaneceram estáveis. A concentração de proteína neuronal aumentou significativamente de 1420,4 microgramas por mililitro no início do estudo para 1748,9 por mililitro em seis horas e 1823,7 microgramas por mililitro 24 horas após a lesão. Os rendimentos de RNA dos grupos de controle e axônio lesionados foram quase idênticos.

O sequenciamento de RNA revelou 595 genes específicos de lesão e 609 genes específicos de controle, com 17.471 genes compartilhados entre os grupos. A análise da via KEGG identificou uma regulação positiva significativa da fosforilação oxidativa, resposta reativa das espécies de oxigênio, autofagia e vias do ciclo do TCA pós-lesão.